胃癌的早期诊断与预警芯片

　　建立胃癌早期诊断及预警系统的研究

　　一、主要研究内容和目标

　　1．主要研究内容

　　（1）正常胃粘膜(包括胃窦部、胃体、胃幽门部粘膜)到癌前变、再到胃癌的差异表达基因的分离与克隆；

　　（2）建立正常胃粘膜（包括胃窦部、胃体、胃幽门部粘膜）到癌前变、再到胃癌的差异表达基因图谱；

　　（3）正常胃粘膜（包括胃窦部、胃体、胃幽门部粘膜）到癌前变、再到胃癌的特征性差异表达基因的筛选；

　　（4）所获差异表达基因植于芯片，运用芯片技术对临床标本进行检测并建立相关数据库；

　　（5）差异表达基因的表达水平在胃粘膜病变过程中的变化规律。

　　2．研究目标

　　建立胃癌早期诊断及预警系统。

　　二、研究的必要性及重要意义

　　胃癌的发病率在我国居恶性肿瘤之首，在世界居第二位。临床医学一直强调胃癌的早期诊断与治疗,以便降低死亡率，基础医学把胃癌发病机制的研究列为重点并取得一些重大成果，初步阐明了100多种基因与胃癌发生发展有关；发现一些致胃癌的物质；研制出一批胃癌单抗，促进了消化医学的发展。但临床的现状是：就诊的患者大多处于胃癌的中晚期，疗效不佳。胃癌的早期诊断难题还远未解决。基础医学研究目的是提高医学质量，如何解决胃癌患者的早期诊断难题呢？我们认为：只有建立胃癌的预警系统，才能够实现这一目标。

　　现代分子生物学研究表明：人类基因组约由10万左右的不同基因组成，这些基因的选择性表达决定了机体整个生命过程，基因表达的变化处于控制生物学调节机制的中心位置。基因表达水平的变化是最根本的变化，也是最敏感的变化，反映了机体特定阶段的生命特征。胃癌是一种基因病，是由多种癌基因抗癌基因参与、多阶段多途径协同作用，使得胃粘膜逐步发展到癌前变再发展到胃癌的这样一个演变过程。正常胃粘膜到癌前变过程及癌前变至胃癌过程皆存在特征性的差异表达基因，只要找出这些基因并阐明这些基因表达水平的变化与胃癌发生发展不同阶段的相互关系及其规律，建立这些基因变化规律的数据库就完全可能预报胃癌。

　　开展此研究，对提高部队战斗力具有重要意义。部队是个战斗集体，胃肠系统疾病严重影响干部战士健康，此研究的成果，可预测胃肠疾病状态，为疾病早期预防奠定了基础；此研究结果带来的经济效益与社会效益都是十分巨大的，同时为解决其它肿瘤的预警难题提供了新的思路，具有深远的影响。

　　三、同类研究工作国内外研究现状与存在的问题

　　1.胃癌的国内外研究现状

　　胃癌是个多因素的疾病，与140多种基因及其蛋白产物密切相关，包括：MAGE-1、2、3，ras、c-myc、met、k-sam、HER2/neu、c-erb-2、midkine等癌基因；p53、p16、p21、DCC等抗癌基因；fas、bcl-2、bcl-x(s)、cycloxygenase-2、cyclinA、cyclinB1、p34cdc2等凋亡及细胞周期相关基因；IRF-1、EGF-1、PDGF-A、AgNOR、b -TGF-1、high-mobility-group-1、bFGF、TGF-b II 型受体、TFF2等生长因子及其受体基因；E-cadherin,caltractin gene、Trypsinogen、Erk、HEK、MMP-2、MAPK、MKP-1、Protein-tyrosine kinase、protein-serine/threonine等信号转导相关基因及蛋白；还涉及cagA、PCNA、UGTA、copA、MIB、p300、BstUI等蛋白；还涉及免疫因素如IL-4、CD24、CD44、IL-8等；胃癌的转移与nm23、CD44、p53、muc1、cerB-2等密切相关。胃癌相关基因主要以扩增、重排、缺失等方式导致其mRNA及蛋白呈高表达、低表达或不表达，来作用于不同阶段的不同环节，引起转导信号紊乱，最终导致胃癌发生发展。因此，我们认为：胃癌从本质上说是多因素引起相关基因表达水平改变的产物，寻找胃癌特异表达基因并阐明其功能具有现实意义。国人在胃癌单抗制备及其应用方面取得重大进展，同时在跟综国际研究过程中进行了一些胃癌相关基因的研究以及HP与胃癌关系的研究，取得了一些进展；我们从95年开始运用mRNA差异展示技术从事胃癌表达基因的研究，分离出胃癌相关基因片段154个，完成部分片段的测序,筛选20个是新序列并被GenBank接受（接受号为AF054162-AF064172，AF071052-AF071058），对其中的二个基因片段进行了cDNA文库的筛选及染色体定位，运用RT-PCR及RNA 杂交技术对68例胃癌及癌旁组织与100例活检胃粘膜标本进行了检测，筛选出6个特异性好、组合检出符合率达92.3%的新基因片段,组成胃癌早期预警系统，这6个基因序列已被GenBank接受，并申请了中国专利（接受号为98112922.6）。我们在HP与胃癌关系的研究方面也取得了一些进展。

　　正常胃粘膜到癌前病变再到胃癌方面的研究进展：正常胃粘膜到癌前变的研究很少，98年日本人TAKESHI WATANABE等把幽门螺杆菌感染Mongolian Gerbils胃粘膜，62周后37%的鼠出现胃癌病理改变；化学物质如raphe pallidus 等可诱导胃粘膜病变；年青人的胃粘膜与老年人胃粘膜存在ep37家族基因的表达水平不同；还有数个基因在胃溃疡粘膜中表达异常；胃粘膜癌前变到胃癌过程的研究也很少，在癌前变粘膜中存在Protein-tyrosine kinase 家族基因的高表达，如ERK，GCYS-18等。

　　2.存在的问题

　　正常胃粘膜到癌前变再到胃癌过程基因变化的研究还是比较少，胃癌的研究还局限于单个基因在胃癌组织中变化的研究，系统化的研究还是少，只有对正常胃粘膜到癌前变再到胃癌过程基因变化规律进行阐明，才有可能解决胃癌的早期诊断难题。

　　四、军队开展此研究所具备的条件

　　1.取材方便，病历完整。

　　在附属医院门诊，各种胃病患者皆能见到，各种胃病标本皆能收集到，特别是胃镜检查的开展，活检胃粘膜标本（胃窦、胃体、胃幽门）特别易获得，而且病理资料与病历资料都完备，为开展此研究奠定了基础。

　　2.克隆技术发展为差异表达基因的获取提供了技术保障。

　　差异表达基因克隆技术十分成熟，特别是差异展示技术的发展与成熟，为短期内分离并克隆正常胃粘膜到癌前变、再到胃癌的差异表达基因奠定了基础。

　　3.芯片技术的发展与成熟为差异表达基因的临床研究奠定了基础。

　　芯片技术的发展与成熟为大量基因的功能性研究提供了条件，同时也提高了效率，为短期内获得大量数据提供了可能。

　　4.部队的科研管理及严格的组织性为多单位科研协作完成课题奠定了基础。

　　五、本研究经费概算及建议承担单位

　　1.经费概念

　　(1)胃粘膜(胃窦、胃体、胃幽门)到胃癌前变（胃窦、胃体、胃幽门）差异表达基因的分离与克隆，需经费50万元；

　　(2)胃癌前变（胃窦、胃体、胃幽门）到胃癌差异表达基因的分离与克隆，需经费50万；

　　(3)克隆的差异表达基因在临床标本中的检测及其临床意义研究，需经费50万元；

　　 特异性差异表达基因的筛选；

　　­ 差异表达基因临床运用数据库的建立；

　　® 相关检索分析软件的开发与运用。

　　2.建议承担单位

　　第四军医大学全军基因诊断技术研究所、北京医科大学肿瘤医院、西安市中心医院、西京医院消化病研究所等单位联合承担。

　　第四军医大学全军基因诊断技术研究所运用DD-PCR技术分离并克隆了部分胃癌与癌前变粘膜之间的差异表达基因，对DD-PCR技术掌握很熟练，分离出胃癌相关基因片段154个，完成部分片段的测序,筛选20个是新序列并被GenBank接受（接受号为AF054162-AF064172，AF071052-AF071058），对其中的二个基因片段进行了cDNA文库的筛选及染色体定位，运用RT-PCR及RNA 杂交技术对68例胃癌及癌旁组织与100例活检胃粘膜标本进行了检测，筛选出6个特异性好、组合检出符合率达92.3%的新基因片段,初步组成胃癌早期预警系统，这6个基因序列已被GenBank接受，并申请了中国专利（接受号为98112922.6）。

　　对完成基因筛选工作奠定了基础；北京医科大学肿瘤医院、西安市中心医院、 西京医院消化病研究所承担并完成了多项重点科研课题，具备完成此研究的标本收集及有关技术条件。

　　胃癌早期诊断及预警基因芯片

　　胃癌的发病率在我国居恶性肿瘤之首，在世界居第二位。研究表明：胃癌是一种基因病，正常胃粘膜到癌前变及胃癌皆存在特征性差异表达基因，找出这些基因并阐明这些基因表达水平的变化与胃癌发生发展不同阶段的相互关系及其规律，建立起这些特征基因变化规律的数据库就能预报胃癌。

　　籍此，我们利用基因打猎技术获得了229个胃癌发展各阶段的特异基因，并将这些基因种植到特殊处理的载体上，制备成基因芯片，从而实现对胃癌的早期诊断和预警。

　　该芯片的研制成功，对于胃癌高危人群的普查，胃癌的早期诊断及治疗效果分析，预后评价等均有重大的现实意义，同时也可产生良好的经济效益。