神经干细胞移植治疗遗传性小脑萎缩的临床研究

[摘要]目的:探索神经干细胞(neural stem cells,NSCs)移植治疗遗传性小脑萎缩(cerebellar atrophy,CA)的临床疗效。方法:8～10周龄人胚胎的小脑细胞在体外稳定扩增后,借助立体定向技术将NSCs(1×107/0.25ml)缓慢注入临床确诊12例遗传性CA患者的小脑齿状核(此前注入地塞米松1mg/0.5ml)。本组男7例,女5例,年龄22～52岁(平均36岁)。结果:人胚胎小脑神经干细胞可以在体外扩增,扩增的细胞可达1×107倍。移植病例未见明显的移植排斥反应。比较术前、术后ICARS评分，CA患者移植术后3个月临床症状改善的有效率为58.3%,术后6个月有效率为75%;随访12～24个月(平均18个月),有效率达66.7%。结论:应用体外扩增的NSCs可以治疗遗传性CA,而且临床安全、有效。

[关键词]小脑萎缩;神经干细胞;细胞移植

Clinical study of transplantation of neural stem cells in treatment of inheritance cerebellar atrophy

TIAN Zeng-Min,LI Zhi-Chao, CHEN Tao,YIN Feng,LIU Shuang

(Neurosurgery Center of PLA,Navy General Hospital,Beijing 100037,China)

[ABSTRACT]Objective:To study the clinical therapeutic effect of transplanting neural stem cells in treatment of heritage cerebellar atrophy(CA).Methods:The cells from human fetal cerebellum(8-10weeks gestation)were expanded in vitro and were allowed to differentiate into neurospheres,the latter were then implanted into dentate nuclei by stereo tactic operation in 12 patients(7 male and 5 female with age ranging 22-62,mean 43)from 2006.8 to 2008.8.Results:The cells of fetal cerebellum were expanded by 107folds in undifferentiated state.The effective rates were 58.3% after 3 months,75.0% after 6 months,and 66.7% after 12-24months(mean 18months).Conclusion:It is feasible and effective to implant the neural stem cells expanded in vitro for treatment of heritage CA,but the long-term effectiveness should be futher observed.

[KEY WORDS]cerebellar atrophy; neural stem cells; cell transplantation

　神经干细胞( neural stem cells,NSCs)在临床应用中有广阔的前景，对它的研究一直是近年来的热点。移植入宿主体内的神经干细胞能够向神经系统病变部位趋行、聚集，并能够存活、增殖、分化为神经元和/或胶质细胞，从而促进宿主缺失功能的部分恢复[1,2]。NSCs可能成为治疗神经退行性疾病(如帕金森病等)的有效手段[3]。本研究采用神经干细胞移植治疗遗传性小脑萎缩(cerebellar atrophy,CA)患者12例,取得了较好的临床疗效。

1　资料和方法

1.1一般资料　本组12例CA患者为本院2006年8月至2008年8月收治的住院患者,男7例,女5例;年龄22～52岁(平均36岁)。病程3～19年(平均8年)。既往病史:明确家族遗传病史，4例基因诊断明确SCA3型。所有患者小脑萎缩症状和体征明显:进行性行走不稳、肢体共济失调、构音障碍、咽反射减弱、精细动作差。伴随症状: 饮水呛咳6例,帕金森病样症状(肢体震颤、僵直)5例,眼球运动障碍7例,肢体痉挛发作4例。所有病例均经临床确诊,其中单纯小脑萎缩4例,小脑萎缩合并脑干萎缩者8例。

1.2人胚胎组织的分离和培养　健康孕妇8～10周孕龄自然流产的胎儿,无菌条件下分离胚胎小脑组织,制备成细胞悬液后接种于含有碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)、表皮生长因子(EGF)和B27因子的无血清培养液中,接种密度为1×105 /ml。生长为神经球后,每隔7～10d传代1次,接种密度为(7.5～10)×104/ml;再次长为神经球的细胞用于移植手术[3]。

1.3手术方法　采用立体定向技术移植用上述方法培养的NSCs。应用MRI扫描定位,机器人辅助无框架脑立体定向手术。选取小脑齿状核作为移植靶点,在局麻状态下,颅骨钻孔,插入穿刺针。应用微量泵,将NSCs(1×107/0.25ml)缓慢注入靶点。植入NSCs前,先往靶点注入地塞米松1mg/0.5ml。留置针10min后，缓慢拔针，缝合头皮切口。术后给予止血、抗感染等常规处理。提供流产胎儿的志愿者和接受治疗的CA患者均填写知情同意书, 并报经医院伦理委员会批准。

1.4疗效评价标准：采用世界神经病联合会国际合作共济失调量表（International Cooperative Ataxia Rating Scale，ICARS），分别评价姿势和步态、运动功能、语言功能以及眼球运动等4大项19小项,总分100分,正常人为0分，分数越高表示神经功能损害越严重。主要观察指标:1、观察术后

不良反应和并发症；2、术前、术后国际合作共济失调量表分值变化；3、患者临床症状体征变化。采用以下公式计算改善率：改善率%=治疗前评分-治疗后评分/治疗前评分。根据改善率将疗效分为痊愈、显效、有效、无效。改善率为100%时为痊愈，改善率＞50%显效，改善率26%~50%为有效，改善率＜25%为无效。

1.5统计学方法　数据以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS11.5统计软件，应用t检验分析。

2　结果

本组12例患者手术过程顺利,无严重出血、颅内感染及颅神经损伤等严重并发症的发生。手术后疗效:术前总评分为25±8.95,术后3月评分为20±8.10,术后6月评分为19±7.90,术后1-2年评分为19±7.10,均与术前差别非常显著（P﹤0.05）（见表1）。部分患者MRI随访,影像显示萎缩小脑在形态上较原病灶有明显饱满改变。脑PET检查移植侧小脑葡糖代谢较对侧升高。本组随访显示,NSC移植术后6个月的症状缓解率高于术后3个月,术后6个月后疗效趋于稳定，部分病例出现症状加重。

不同时间ICARS评分（x±s）

病例

ICARS评分

术前

32

25±8.95

术后3月

32

20±8.10

术后6月

32

19±7.90

术后1-2年

32

19±7.10

（P﹤0.05）

3　讨　论

小脑萎缩是一组以共济失调为主要表现的中枢神经系统疾病, 病理主要表现为小脑蒲肯野细胞的丧失、颗粒层变薄、齿状核神经元脱失伴胶质变性。迄今,其发病原因尚不清楚,亦无有效的治疗措施。现己发现移植孕13～15d小鼠的小脑细胞悬液,能够改善受体小鼠的平衡运动功能障碍[4]。临床上应用胚胎小脑组织悬液移植治疗小脑萎缩可取得一定疗效, 但由于供体细胞来源困难,限制了其在临床的广泛应用[5]。

近年来研究[6,7]证实中枢神经系统存在着具有多分化潜能和自我更新能力的神经干细胞, 它们在一定的条件下能够进行增殖, 并可以向特定的方向进行诱导分化, 这使得中枢神经系统损伤和神经退行性疾病的NSC的替代治疗成为可能。本实验中,NSC在体外进行分裂增殖, 被移植入神经缺损部位, 在局部微环境的影响下分化成相应的受损细胞,重建神经环路, 产生神经营养因子或神经保护因子,从而抑制神经变性或促进神经的再生[8]。本研究中心的前期工作[3]证实, 从 11 周龄以前的胚胎中分离的神经干细胞,在EGF、bFGF存在的条件下可以在体外稳定的扩增(时间达1年以上),并且具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力。移植小脑的NSC 能否分化为蒲肯野细胞, 其关键还在于N SC 分化调控的机制和影响因素。我们在用含有 EGF、bFGF 的培养基培养N SC 时发现, 所培养的NSC能够保持其生物学特性, 而且可以得到足够数量的细胞用于移植, 数量可以达到1×107/0.1ml,从而为临床治疗奠定了基础。小脑组织移植治疗小脑萎缩是否有移植排斥反应是困扰临床应用的另一个问题。多数作者认为, 血脑屏障的存在和脑内淋巴系统的缺乏对保护移植物的存活中起到了十分重要的作用。移植的神经干细胞缺乏免疫原性也不易被破坏[9]。本组32例CA 患者在移植治疗后无排斥反应的发生,佐证了上述结论,有理由相信N SC可能是一种理想的移植治疗物,可用其移植治疗神经退行性疾病。

目前应用体外扩增的N SC 治疗神经退行性疾病还处在临床探索阶段[10]。本组 32例CA患者采用立体定向移植治疗无明显并发症的发生,术后无病情加重者。临床治疗有效率有随时间延长而上升的趋势