ELISA法测定糖原磷酸化酶同工酶

　　糖原磷酸化酶( Glycogen phosphorylase,EC2.4.1.1 GP)有三种同工酶;脑型(GPBB)、肌型(GPMM)和肝型(GPLL)。GPBB亦存在于心肌。该酶对心肌缺血缺氧敏感，可作为早期急性心肌梗死(AMI)的辅助诊断指标，对非典型的急性心肌梗死诊断尤为重要。根据实验室条件，将纯化GPBB制备单克隆抗体以ELISA法测定GPBB酶蛋白含量。该方法具有简便、快速、敏感、稳定等优点，适于临床常规及急诊应用。

　　1 材料和方法

　　1.1 对象 78名正常健康体检者(男55名，女23名，年龄23～62y)。根据年龄分为A、B、C 3组：A，23～28y：B，31～42y：C，45～62y。25名AMI(男21名，女4名，年龄54～68y)，诊断标准根据临床症状，心电图，心肌酶测定。

　　1.2 标本采集 静脉采血，分离血清，-20℃冰箱保存。测定时放室温融化。

　　1.3 试剂和仪器 猪心肌，CM-sepharose CL-6B(Pharmacia)，5'-AMP-sepharose(Pharmacia)，BALB/c小鼠，IMDM培养基(G18CO)，低温超速离心机(日本)，CO 2 细胞培养箱(日本)，紫外分光光度计(岛津)，酶标仪(Model430)。

　　1.4 方法 GPBB抗原制备：根据资料加以改良。心肌去被膜，剪碎，取100g加300ml提取液(磷酸盐缓冲盐水pH6.8，含1mmol/L EDTA，300mmol/L巯基乙醇，5mmol/L磷酸甘油)制成匀浆，以2100r/min，4℃离心30min。取上清液用饱和硫酸铵和硫酸铵粗提取，以15000r/min，4℃离心20min。沉淀以20 ml pH6.8磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶解，透析后上CM-sepharose CL-6B柱，收集GPBB酶蛋白。浓缩，透析后上5'-AMP-sepharose柱，收集GPBB酶蛋白，测定酶蛋白含量，保存在-20℃条件下。单克隆抗体制备;将纯化GPBB 100μl(酶蛋白含量250 mg/L)，加福氏完全佐剂0.2ml，腹腔注射8w龄BALB/c小鼠，取BALB/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，基础培养基为IMDM，选择培养基为HAT。用间接ELISA法筛选阳性克隆，以45g/dl饱和度硫酸铵纯化单克隆抗体，放-20℃保存。GPBB测定方法：取纯化的抗GPBB单克隆抗体，用0.2mol/L pH7.5PBS稀释成25 mg/L，包被聚苯乙烯酶标板，每孔200μl，37℃包被8h，用洗涤液(含 1 g/dl牛血清白蛋白，0.05%Tween-20,pH7.4PBS)冲洗三次，干燥。包被好的酶标板于4℃可存放6mo。用时放室温30min,加100μl血清标本及阳性对照(纯化GPBB抗原)，阴性对照(稀释液)。37℃水浴15min洗涤，吸干，加200μl酶标抗体(辣根过氧化物酶标记GPBB单克隆抗体)，37℃水溶15min,加200μl显色液[含邻苯二胺0.04%，0.05%(v/v)H 2 O 2 的醋酸缓冲液pH5.0]，37℃水溶10min，以2mol/L，H 2 SO 4 50μl终止反应，检测波长为490nm。根据标准曲线得GPBB浓度。标准曲线绘制：配制8份0.8～120μg/L倍比浓度GPBB纯品，按操作方法每个浓度标准品作3次，取平均值。吸光度为纵坐标，标准浓度为横坐标，绘制标准曲线。

　　1.5 统计学方法　以均数加减标准差( ±s)表示统计数据。

　　2 结果

　　2.1 方法简单　纯化的 GPBB在聚丙烯酰胺圆盘电泳上为单一区带在琼脂凝胶板免疫电泳上与抗人全血清未见沉淀线。比活力为268 u/mg。抗GPBB免疫效价为1∶32，与GPMM，GPLL不发生交叉反应。抗体抑制率为95%。方法的回收率为102%±2.4%，低值和高值的批内批间变异分别为5.1%，7.4%和6.2%，10.4%。线性可达100 μg/L。

　　2.2 ELISA方法最适条件试验　以吸光度1.025为包被最适浓度，对5～50mg/L稀释度的包被液进行测定，其最适包被条件为：包被浓度25mg/L;包被时间8h(37℃)。对试验中各反应步骤反应时间的观察，最适免疫反应分别为15min，显色时间为10min。

　　2.3 参考值范围　测定 78名健康体检者，统计数值以均值加减标准差( ±s)表示。男性值为3.81±1.3，女性值为3.74±1.5。A、B、C 3组测定值分别为3.71±1.2，3.80±1.6，3.78±1.3。性别和各组年龄之间无显著性差异(P>0.05)。均值加2个标准差的参考值范围为1.05～6.53μg/L( =3.79,s=1.37)。

　　2.4 GPBB确诊AMI界线值　根据回顾性数据统计，GPBB值为7.9μg/L占100%。

　　3 讨论　 GP为糖原分解的关键酶，在心肌细胞肌浆网构成糖原分解复合物，该复合物对缺血引起的糖原分解特别敏感，使其构成发生改变，形成可溶性GPBB，透过细胞膜进入血液。以心肌为原料纯化GPBB，结果达到电泳纯和免疫纯，其单克隆抗体与GPMM、GPLL不出现交叉反应。ELISA测定方法一般时间较长，经过操作过程亚最适反应时间优化，通过加大包被浓度，缩短包被时间，经实验观察，抗原抗体反应时间为15min，显色时间为10min可得到良好的实验效果，时间延长未见明显变化。酶标板包被后，冰箱保存可用半年，用时加血清和试剂，测定全程约需40min，明显缩短操作时间，适于临床常规和急诊测定。测定78名健康体检者，年龄23～62 y，参考值范围为1.05～6.53μg/L，性别和年龄之间无显著差别。经临床观察，25名AMI患者发作后4hGPBB明显升高，其确定诊断域值7.9μg/L，可作为临床诊断心肌缺血的早期敏感指标。

（实习编辑：陈战锋）