利用CRISPR/Cas9系统治疗HBV感染取得突破性进展

　　乙型肝炎病毒（HBV），简称乙肝病毒，是一种DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒科（Hepadnavividae），可导致肝硬化和肝癌的发生，给全球带来严重的疾病负担。据世界卫生组织（WHO）报道，全球有20多亿人曾受到过乙型肝炎病毒（HBV）感染，大约3.5亿至4亿人罹患慢性乙肝病毒（HBV）感染，在亚洲和非洲发病率尤其高。我国的乙肝病毒感染率约60%-70%；乙肝表面抗原携带率约占总人口的7.18%，以此计算，全国约有9300万人携带乙肝病毒，其中慢性乙型肝炎患者约2000万例。

　　尽管现有的抗病毒药物可以控制乙型肝炎病毒，但却不能完全清除它。因此，一旦停止治疗患者肝脏中的HBV会重新活化。这是因为cccDNA “匿藏”在细胞核中。

　　细胞外的乙型肝炎病毒DNA是一种松弛环状的双链DNA（relaxed circularDNA，rcDNA）分子。HBV的基因组（rcDNA）进入到细胞核后，rcDNA在病毒蛋白和宿主细胞因子的帮助下修复成共价闭合环状DNA（cccDNA）。cccDNA是乙肝病毒前基因组RNA复制的原始模板。

　　只要还存在于肝细胞中，乙肝病毒cccDNA的复制就不会停止，并与病毒蛋白装配成新的完整HBV病毒颗粒，以芽生的方式再感染健康的肝细胞，而这是导致乙肝复发的根本原因。因此，尽管每个肝细胞内只有约5～50个cccDNA拷贝，但是只要这些cccDNA池稳定，就可以使得病毒的持续感染延续，因而清除肝细胞内的cccDNA是乙肝彻底治愈所必需的。

　　CRISPR/Cas9系统靶向结合特异性的DNA序列，诱导靶DNA双链发生精确切割。在哺乳动物细胞中，这样的切割能够被一种被称作非同源末端连接（non-homologous end-joining， NHEJ）的紧急修复系统快速地修复。NHEJ是高效的，但是并不很准确，因而经常导致一些DNA碱基在修复位点上插入或剔除。鉴于每次读取DNA时是按密码子（每个密码子由连续的三个碱基组成）读取的，在关键位点上发生的这些小的DNA序列变化经常破坏相应的基因和它的蛋白产物的功能。基于，世界各地的研究人员尝试利用CRISPR/Cas9系统治疗HBV感染，并且取得重大进展。

　　1. Sci Rep：利用CRISPR/Cas9系统高效地抑制HBV

　　Scientific Reports， 02 June 2015， doi：10.1038/srep10833

　　在一项新研究中，麻省理工学院的研究人员利用CRISPR/Cas9 系统，对受到HBV感染的哺乳动物肝细胞进行基因组编辑，从中删除了乙肝病毒（HBV）DNA。他们靶向切割了HBV病毒共价闭合环状DNA（cccDNA）中的一些特异性位点。

　　在这项研究中，Vyas Ramanan和同事们设计了24条单向导RNA（sgRNA）来靶向从在线病毒序列信息资源库中鉴别出的一些HBV基因组位点。经过初筛测试后，研究小组将三种最有效的sgRNA和Cas9蛋白插入到慢病毒载体中，然后将它们转导进将HBV DNA整合到宿主基因组的人类肝细胞内。

　　通过利用包含整合性HBV基因组DNA的稳定转染细胞系展开实验，研究人员观察到HBV总DNA和cccDNA逐渐减少，在36天时cccDNA下降了92%。他们还观察到HBV病毒基因表达和复制水平显著减少。

　　如今，Ramanan计划在人类肝脏嵌合小鼠模型中测试这一方法，以评估和优化传递方法和给药方法，及更好地了解需要除去多少的cccDNA才能到达人类功能性的治愈。

　　2. Mol Ther Nucleic Acids：利用CRISPR/Cas9抑制HBV感染

　　Molecular Therapy Nucleic Acids， 2014 December; 3(12)： e216， doi：10.1038/mtna.2014.68

　　在一项新的研究中，为了研究源自传染性HBV的cccDNA是否能够被直接靶向摧毁，来自美国福克斯蔡斯癌症中心（Fox Chase Cancer Cente）的研究人员在表达HBV受体---钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白（sodium taurocholate cotransporting polypeptide， NTCP）---的人HepG2中使用CRISPR/Cas9基因编辑系统。他们测试了不同的HIV特异性的向导RNA（gRNA），并证实它们能够高达8倍地抑制HBV感染。这种抑制是HBV cccDNA发生突变和缺失---类似于Cas9切割染色体DNA和随后基于NHEJ介导的DNA修复时观察到的情形---所导致的。α干扰素（IFN-α）并不对CRISPR/Cas9系统的抗病毒活性产生可衡量的影响，这提示着Cas9和NHEJ活性并不受这种细胞因子（即IFN-α）诱导的先天免疫反应的影响。

　　3. Mol Ther：利用CRISPR/Cas9让HBV cccDNA功能性灭活

　　Molecular Therapy， online publication 21 June 2016; doi： 10.1038/mt.2016.94

　　在一项新的研究中，通过采用下一代测序（NGS）技术，来自美国福克斯蔡斯癌症中心（Fox Chase Cancer Cente）的 Christoph Seeger、Ji A Sohn和同事们确定了在Cas9切割和基于非同源末端连接（NHEJ）的修复后，HBV cccDNA所发生的完整突变谱。他们发现，90%以上的乙肝病毒DNA都能被Cas9切割。此外，研究结果还表明，在Cas9切割后对HBV DNA进行基因编辑的效率是在对被HBV感染的细胞进行α干扰素（IFN-α）处理后发生的APOBEC蛋白介导的胞嘧啶脱氨基作用的1500倍以上。研究还发现，以前用来检测DNA胞嘧啶脱氨基作用的3D-PCR方法方法高估了发生基因编辑的HBV DNA的数量和频率。

　　总之，研究人员证实CRISPR/Cas9系统是迄今为止在功能上让HBV cccDNA失活和提供一种慢性乙肝治愈疗法的最好途径。

　　4. Gene Ther：我国科学家利用CRISPR破坏乙肝病毒

　　Gene Therapy， 2015， 22， 404–412; doi：10.1038/gt.2015.2; published online 5 February 2015

　　2015年2月5日，来自我国军事医学科学院放射与辐射医学院研究所、第四军医大学西京医院、日本京都大学和华中农业大学兽医学院等处的研究人员，在Nature旗下Gene Therapy期刊上发表一项最新的研究成果，题为“Harnessing the clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated Cas9 system to disrupt the hepatitis B virus”。 在这项研究中，研究人员研究靶向乙肝表面抗原（HBsAg）编码区的CRISPR/Cas9系统，在体外培养的肝细胞中和活的小鼠体内的效果。结果表明，CRISPR/Cas9可在体内和体外抑制HBV复制和表达，可能是治疗HBV感染的一种新策略。

　　5. Mol Ther Nucleic Acids：利用CRISPR/Cas9系统在体内促进肝内HBV模板清除

　　Molecular Therapy Nucleic Acids， 2014， 3， e186; doi：10.1038/mtna.2014.38

　　在当前的抗病毒治疗下，HBV cccDNA持续存在是根治慢性乙肝的一大障碍。治愈慢性乙肝需要新的策略来特异性地破坏HBV cccDNA。为了研究CRISPR/Cas9系统是否能够切割HBV基因组，来自中国国立台湾大学的研究人员设计出8种针对A基因型HBV的gRNA。利用这些HBV特异性的gRNA，CRISPR/Cas9系统显著性地降低感染上HBV表达载体的Huh7细胞中的乙肝核心抗原（HBcAg）和乙肝表面抗原（HBsAg）产生。在这8种筛选出的gRNA中，他们鉴定出两种有效的gRNA。有趣的是，其中的一种靶向保守性HBV序列的gRNA在不同基因型的HBV中都能发挥作用。

　　利用一种流体动力学-HBV持续存在小鼠模型，研究人员进一步证实这种CRISPR/Cas9系统能够切割肝内含有HBV基因组的质粒，促进它在体内被清除，从而导致血液中的HBsAg水平下降。

　　这些数据提示着CRISPR/Cas9系统能够在体外和体内破坏HBV表达模板，并且表明它有潜力根除持续性HBV感染。

　　6. Virus Res：利用CRISPR/Cas9系统在体内和体外诱导抗HBV效应

　　Virus Research， Volume 217， 2 June 2016， Pages 125–132， doi：10.1016/j.virusres.2016.04.003

　　在一项新的研究中，来自中国同济大学生命科学与技术学院的研究人员利用CRISPR/Cas9系统靶向剔除HBV基因组中的保守性区域。通过让核酸内切酶Cas9携带HBV S基因和X基因的同源序列，他们构建出pCas9。通过利用pCas9开展实验，他们证实pCas9-2能够更好抵抗HBV产生，而且在Huh7和HepG2细胞之间没有显著差异。

　　在M-TgHBV的HBV感染小鼠模型中，注射pCas9会降低血液中的HBsAg水平和肝脏中的HBcAg水平。

　　总之，这种人工构建的CRISPR/Cas9系统能够诱导抗HBV效应，而且有潜力作为一种新的疗法治疗慢性HBV感染。

　　7. Sci Rep：利用CRISPR/Cas9系统破坏HBV S基因和X基因保守性序列

　　Scientific Reports， 2015 Sep 3;5：13734. doi： 10.1038/srep13734

　　为了在治疗上应用于人体，人工设计出的核酸内切酶Cas9应当能够识别不同基因型的HBV，同时产生最小的脱靶效应。

　　针对此，在一项新的研究中，德国研究人员鉴定出HBV基因组的S区域和X区域在不同基因型中都保守的HBV序列，而且能够利用一种Cas9酶特异性地和高效地靶向切割这些保守性序列。这一方法不仅破坏报告细胞系中的游离HBV cccDNA和HBV在染色体上的整合靶位点，而且也破坏慢性感染和新感染的肝癌细胞系中的HBV复制。

　　这些数据提示着将CRISPR/Cas9系统作为旨在治愈HBV感染的新策略具有可行性。

　　8. World J Gastroenterol：利用双gRNA指导的CRISPR/Cas9系统高效地抑制HBV复制

　　World Journal of Gastroenterology， 2015 Aug 28; 21(32)：9554-65， doi：10.3748/wjg.v21.i32.9554

　　为了筛选和研究有效地抵抗A、B、C和D基因型HBV的gRNA，来自中国北京大学医学部的研究人员总共设计出15种gRNA（分别记为gRNA-1，gRNA-2，…，gRNA-15）。他们从中选择了11种靶向HBV基因组调节区域的双gRNA组合。他们研究了每种gRNA和这11种双RNA组合抑制A、B、C和D基因型HBV复制的效率。

　　研究人员证实所有的gRNA能够显著地抑制体外细胞培养物中的HBsAg或HBeAg产生，所有双RNA组合能够高效地抑制A、B、C和D基因型HBV中的HBsAg或HBeAg产生，而且当与单个gRNA相比时，双RNA组合抑制HBsAg或HBeAg产生的效率显著增加。

　　再者，通过利用PCR直接测序，研究人员证实这些双gRNA组合能够通过移除这两种使用的gRNA的切割位点之间的序列片段，特异性地破坏HBV表达模板。最为重要的是，gRNA-5和gRNA-12的双gRNA组合不仅能够高效地抑制HBsAg和/或HBeAg产生，而且也破坏HepAD38细胞中的HBV cccDNA池。

　　这些结果提示着CRISPR/Cas9系统能够高效地破坏HBV表达模板（A、B、C和D基因型HBV），而且没有明显的细胞毒性。

　　9. J Gen Virol：利用CRISPR/Cas9系统抑制不同基因型HBV复制

　　Journal of General Virology， 2015 Aug;96(8)：2252-61， doi：10.1099/vir.0.000159

　　为了研究利用CRISPR/Cas9系统是否可能破坏HBV DNA模板，来自中国武汉大学的研究人员设计出8种靶向不同基因型HBV的保守区域的gRNA，而且这些gRNA能够在体外和体内显著地抑制HBV复制。再者，这种HBV特异性的gRNA/Cas9系统能够抑制不同基因型HBV在细胞中的复制，而且利用单个gRNA/Cas9系统能够显著降低HBV DNA，而且利用不同的gRNA/Cas9系统组合能够清除HBV DNA。

　　10. Antiviral Res：利用CRISPR/Cas9系统高效抑制HBV复制

　　Antiviral Research， Volume 118， June 2015， Pages 110–117， doi：10.1016/j.antiviral.2015.03.015

　　作为一种新的基因组编辑工具，CRISPR/ Cas9系统能够被用来准确地和高效地改造和修饰基因组DNA。

　　在一项新的研究中，来自中国苏州大学的研究人员合成出4种靶向HBV基因组保守区域的单向导RNA（sgRNA）。在Huh7细胞和HBV复制性细胞HepG2.2.15中，CRISPR/ Cas9系统降低HBV产生。他们进一步证实CRISPR/Cas9的直接切割和这种切割介导的突变发生于转染细胞的HBV cccDNA中。

　　在携带HBV cccDNA的小鼠模型中，通过快速地尾静脉注射含sgRNA-Cas9的质粒导致较低水平的HBV cccDNA和HBV蛋白产生。

　　总之，这种CRISPR/Cas9系统能够准确地和高效地靶向HBV cccDNA和抑制HBV复制。它有可能被用来治疗慢性HBV感染。

　　11. Virology：利用CRISPR/Cas9系统抑制HBV DNA积累

　　Virology， Volume 476， February 2015， Pages 196–205， doi：10.1016/j.virol.2014.12.001

　　在一项新的研究中，来自美国杜克大学和埃默里大学的研究人员通过对细菌Cas9基因和单向导RNA（sgRNA）进行慢病毒转导，观察到在体外的HBV慢性感染和新感染的模型中，HBV DNA产生受到高效抑制。HBV特异性的Cas9/sgRNA组合降低总HBV DNA水平高达1000倍左右和降低HBV cccDNA水平高达10倍左右，而且也通过突变让残留的绝大多数HBV DNA失活。

　　总之，这些数据提供概念验证表明CRISPR/Cas9系统有潜力有效地剔除慢性HBV感染者体内的HBV cccDNA池。