依托考昔对低氧缺塘诱导PC12细胞损伤的保护作用

　　脑缺血是临床上的常见病，死亡率很高。缺血性脑损伤引发了包括炎症、坏死和凋亡在内的一系列复杂的病理生理过程。

　　环氧化酶(cyclooxygenase，COX)是催化花生四烯酸合成前列腺素和血栓素的限速酶。研究表明，COX参与了脑缺血损伤的发生及发展，与脑缺血的预后关系密切。

　　依托考昔为选择性COX-2抑制剂，是一种非甾体类抗感染药，可以特异性地抑制COX-2的表达，抑制AA代谢转化成PDE2。

　　本研究以PC12细胞低氧缺塘(OGD)模型模拟脑缺血损伤，探讨新型COX-2抑制剂依托考昔对脑缺血损伤的影响，以期为依托考昔在临床上治疗脑缺血提供理论依据。

　　1材料与方法 1.1试剂及仪器 DMEM培养基、胎牛血清，MTT，LDH试剂盒，COX-2抑制剂，羊抗鼠荧光，依托考昔尼莫地平。

　　1.2方法 1.2.1细胞培养 PC12细胞由浙江大学神经药理教研室馈赠。PC12细胞培养与含有10%胎牛血清，青、链霉素各100U/ml的高糖DMEM培养基中，置于37°C饱和湿度、含5%CO2和95%空气的恒温箱中培养，0.25%胰蛋白酶消化传代。待细胞传至10~20代时进行试验。

　　1.2.2PC12细胞OGD模型的建立PC12细胞以1*10^4孔的密度接种于96孔板内，贴壁24h后处理。培养板内细胞以无糖Earles平衡盐溶液洗涤2次，换成无糖OGD液，将培养板置于密闭OGD灌内，通以95%N2-5%CO2气体，通气30min后，置于37°C培养箱内培养相应时间。

　　1.2.3药物处理 PC12细胞接种于96孔板贴壁后，给以不同浓度的依托考昔预处理30min，换成OGD液进行OGDen处理相应时间，OGD过程中全程给药。采用尼莫地平作为阳性对照。

　　1.2.4 MTT法检测PC12细胞存活率 细胞经OGD处理后，将孔内液体换成有糖OGD液，加入MTT液使终浓度为0.5mg/ml，继续培养4h后，弃去孔内液体，加入100ml二甲基亚砜溶解蓝紫色复合物，振荡10min，于酶标仪上490nm波长处测定吸光度值。

　　1.2.5乳酸脱氢酶(LDH)活性检测细胞损伤 细胞OGD及药物处理后，收集培养上清液，按照LDH试剂盒说明操作并计算LDH释放率，并于对照组比较。

　　1.3统计学方法数据以均数+-标准差表示，经SPSS12.0软件统计，两组间各项检测指标进行One-way ANOVA分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

　　2结果 2.1OGD处理诱导PC12细胞损伤镜下观察，正常的PC12细胞清晰可见，呈梭状;OGD损伤后细胞皱缩、结团，胞体折光性下降。OGD 4h细胞开始出现损伤，存活率为对照组的87%左右，OGD 6h细胞存活率为对照组的68%左右，与对照组比较，差异有高度统计学意义。

　　2.2 COX-2抑制剂依托考昔对PC12细胞OGD损伤的保护作用 COX-2选择性抑制剂依托考昔能明显改善OGD诱导的PC12细胞损伤的形态学变化。与对照组比较，40~80mmol/L依托考昔能显著增加OGD 6h后PC12细胞的存活率，并降低LDH释放率。

　　3讨论缺血性脑损伤在临床上较常见，因其较高的发病率、死亡率、致残率及复发率影响生存质量。缺血性脑损伤时，花生四烯酸通过代谢产生大量TXA2、PGs及白三烯等炎性物质。

　　TXA2和部分前列腺素可诱导血小板聚积、脑血管痉挛与血管通透性增加，促进血-脑屏障开放，加重脑损伤与脑水肿形成。同时，花生四烯酸经COX-2mRNA与蛋白水平也有显著增加。

　　同时研究表明，在大鼠脑缺血-再灌注模型中，COX-2选择性抑制剂NS398、塞米昔布等均能通过缩小梗死面积减少PGE2的聚集，减少氧自由基产生，提高SOD活性减轻缺血后损伤，从而产生脑保护作用。另一种COX-2抑制剂尼美舒利能降低血-脑屏障通透性及白细胞浸润，从而保护脑损伤。

　　本研究表明，依托考昔在离体水平上能显著保护OGD诱导的PC12细胞损伤。经依托考昔处理后，PC12细胞存活率与对照组比较，在浓度为40~80mmol/时有显著性增加，同时LDH释放率显著降低，显示依托考昔对OGD诱导的PC12细胞损伤具有显著的保护作用。

　　脑缺血是临床上的常见病，死亡率很高。缺血性脑损伤引发了包括炎症、坏死和凋亡在内的一系列复杂的病理生理过程。

（实习编辑：张丽娟）