相关毛孢子菌生物学特性的研究

　　除了念珠菌病、曲霉病等常见的真菌感染外，由非念珠菌属酵母菌所致的感染在免疫受损人群中日渐增多，而且病情严重，毛孢子菌病就是其中之一。毛孢子菌病是指由毛孢子菌引起毛发、指甲、皮肤甚至全身系统性感染的一类真菌病，能够引起人类感染的常见致病菌种主要有阿萨希毛孢子、皮毛孢子、皮瘤毛孢子、星形毛孢子以及倒卵型毛孢子等。尽管毛孢子属都可以形成关节孢子，但这点对于种水平的鉴定并没有帮助；根据文献报道，不同种的毛孢子菌对抗真菌药物的敏感性有一定的差异，比如阿萨希毛孢子菌对两性霉素B敏感，而皮肤毛孢子菌对其耐药，因此将毛孢子菌鉴定到种水平对于合理选择抗真菌药物，有效治疗毛孢子菌感染具有重要的意义。

　　自2001年国内首次报告毛孢子菌的播散性感染以来，有关毛孢子菌病的报道日渐增多。但是，人们对于毛孢子菌特性的了解仍然较少，毛孢子菌属的鉴定方法和毛孢子菌病的诊断手段还需进一步完善。我们对北京大学真菌及真菌病研究中心所保藏的部分病原性毛孢子菌，从形态学、生理生化、分子生物学，以及抗真菌药物敏感性等方面进行了系统的研究，希望为毛孢子菌感染的诊断和治疗提供参考。

　　材料和方法

　　l、菌株来源：本研究选用经常规方法鉴定的毛孢子菌属临床分离株共13株，阿萨希毛孢子、皮毛孢子以及皮瘤毛孢子标准株各l株。所有菌株均来自本研究中心。

　　 2、菌落形态观察：通过将菌株接种土豆葡萄糖琼脂(PDA)，沙堡弱葡萄糖琼脂(SDA)，脑心浸汁琼脂(BHA)，燕麦琼脂(OA)，玉米琼脂(CMA)，察氏琼脂((CDA)、PDA+酵母浸膏的培养基上、在28℃以及35℃培养10d，观察菌落大小以及形态。所有培养基均购之Difco公司。

　　3、镜下形态观察：所有菌株分别接种于PDA培养基上，28℃增养6d，观察镜下形态。

　　4、生理学试验：将实验菌株接种于PDA斜面上在28℃培养5d，然后应用A Pl 20 C AUX系统矩过检测不同菌株对不同糖的同化反应来鉴定菌株。

　　5、ITS区序列测定：将上述菌株接种于PDA斜面上在28℃培养5 d用氯化苄法提取基因组DNA；然后以聚合酶链反应(PCR)扩增核糖体DNA的内转录间隔一区、二区以及其间的5.8S核糖体DNA，引物的序列为：ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’, ITS 4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’：PCR反应体系为50μL，包含引物20pmmol，dNTPs各2.5mmoI/L，Taq DNA聚合酶lU．10×PCR缓冲液(100mmol/L Trls-HCI,20mmol/L MgCl2,500 mmol/L KCI，1.0％Tritonx-loo) μL以及菌株基因组DNA 50ng。实验室标准化委员会(NCCLS)推出的《母菌液基稀释法抗真菌药敏试验方案》州27_A)测定常用抗真菌药物两性霉素B、伊曲康唑、氟康唑以及特比萘芬对于受试菌株的Mc值。

　　结  果

　　1、形态学：阿萨希毛孢子菌(T·asahii)是临床中最为常见的毛孢子菌。菌落形态随培养基以及温度的变化不大。在28℃以及35℃生长10 d后，菌落的直径在16～22mm之间，中心呈白色、粉尘状同边有皱褶、脑回样。镜下关节孢子丰富、末端呈圆形。

　　皮毛孢子菌(T．cutantun)在2℃培养10 d以后，菌落呈奶酪色，脑回状，有宽而闪光的边缘带，直径在16～20mm之间。镜下常常可以见到菌丝断裂为关节孢子，但也可以见到亚球形的芽生孢子。皮毛孢子不能在35℃生长。

　　皮瘤毛孢子菌(T．inkin)菌落表面也是粗糙不平，呈脑回状，在培养过程中常常使培养基裂开，颜色为白色、粉样。在28℃以及35℃培养10 d以后，菌落直径在12～16mm之间。镜下可见菌丝断裂成直角形的关节孢子，此外还可以见到鹿角菌丝。

　　头状地霉菌(G．capitatus)菌落形态与毛孢子菌相比无明显差别，在28℃以及35℃培养10d以后，其菌落直径在15～20mm之间。菌丝成锐角分支扩展，断裂后形成关节孢子，镜下不见芽生孢子。

　　真皮毛孢子菌(T．dermatis)在28℃以及35℃培养10 d以后，其菌落直径为12～15mm，由气生菌丝丛的存在，菌落呈短绒状。在28℃PDA培基上生长6d以后，形成丰富的假菌丝以及真菌,常常呈波浪状，分枝以很小的角度发出，卵圆形的芽生孢子常常位于菌丝末端的侧面。

　　2、生理学试验：使用API 20C AUX系统，仅阿萨希毛孢子菌、皮瘤毛孢子菌能准确鉴定到种。对于其他的毛孢子菌以及头状地霉菌，则必须综合其他实验室鉴定手段。

　　3、ITS序列分析：应用真菌通用引物扩增头状地霉、阿萨希毛孢子菌、皮毛孢子菌、皮瘤毛孢子菌及真皮毛孢子菌的ITS区，发现其序列长度在48l～541bp之间，各不相同。将所得序列通过核苷酸的BLAST程序在Genbank中进行比对可以将菌株鉴定到种。通过ITS区多序列比对，可以区分上述不同毛孢子菌种以及头状地霉之间的差异。而同种之间(阿萨希毛孢子菌株以及头状地霉菌株之间) ITS序列仅存在微小的差异。

　　依据以上多种试验方法的鉴定结果，16株菌中的6株最终鉴定为阿萨希毛孢子，l株为皮瘤毛孢子，l株为皮毛孢子，l株为真皮毛孢子，5株为头状地霉菌，另有2株无法鉴定到种。

　　4、体外抗真菌药物敏感性试验：所有受试菌株对氟康唑均敏感或剂量依赖性敏感，阿萨希毛孢子菌标准株以及真皮毛孢子菌对伊曲康唑敏感，其他大部分受试菌株，包括阿萨希毛孢子菌、头状地霉、皮毛孢子菌以及皮瘤毛孢子标准株对伊曲康唑、特比萘芬及两性霉素B均不敏感。

　　讨  论

　　毛孢子菌属属于半知菌，芽生菌纲，隐球酵母目，隐球酵母科，尚未发现其有性期。近年来，由于免疫受损宿主的增加，毛孢子菌病呈逐年上升的趋势。大部分致命的播散性感染发生在白细胞减少的白血病以及淋巴瘤患者中，深部感染的毛孢子菌常常预后不好，有极高的死亡率。

　　毛孢子属突出的形态学特征就是关节孢子的形成，但不管是菌落形态还是小培养镜下特点对于种问的鉴定都没有帮助。另一种常用的鉴定方法是碳源同化试验，主要是通过测定真菌在有氧情况下利用不同糖类作为惟一碳源的能力来鉴定真菌。API 20C AUX就是据此原理开发，目前已经商业化的一个试剂盒。API 20C AUX系统对于阿萨希毛孢子以及皮瘤毛孢子以外的毛孢子菌均无法准确鉴定。对于临床上最常见的阿萨希毛孢子菌，该系统可以鉴定到种，但其他毛孢子菌与此存在交叉。另外简单的温度试验就能鉴别阿萨希毛孢子以及皮毛孢子，前者能在35℃生长，而皮毛孢子菌在35℃不能生长，它常常是一种浅表真菌感染的病原菌。除了上述方法，可供选择的鉴定方法还有尿素酶试验、酚氧化酶试验以及氮源同化试验等。这些传统方法费时，不宜将毛孢子菌鉴定到种；而且需要根据不同情况选择不同方法黑求技术人员必须具备丰富的经验，大大限制了在临床的广泛应用。

　　 随着分子生物学理论与技术的迅猛发展，这种技术已经广泛应用到了病原微生物的研究与诊断中。由于真菌的iDNA相当保守，但其ITS区相对进化较快，在同一属内不同菌种之间存在变异，因此ITS测序具有菌种分类鉴定的意义。由于毛孢子菌属大部分种的ITS序列在Genbank中均可以查到，所以通过PCR,iDNA ITS序列测定即能对大部分毛孢子菌进行种问鉴定。我们的研究也证实这是一种方便、快速、准确的鉴定方法。

　　头状地霉菌(Geotrichum capitatum)也是一种机会性致病真菌，其有性期为头状双足囊菌(dipodascus capitatus)，其他的名称还包括头状毛孢子(Trichosporon capitatus)，头状芽生裂殖酵母(Blastoschizomyces capitatus)以及芽生裂殖假毛孢子(Blastoschizomyces p seudo trichosporon)。该菌常常引起肺部的疾患，最近在血液病的免疫受损患者中，陆续有该菌感染的报道。由于镜下可见菌丝分裂为长形的关节孢子，临床上容易将此菌误认为毛孢子菌，但此菌在镜下只见关节孢子，而没有芽生孢子、可以和毛孢子菌相鉴别。

　　1997年NCCLS推出了关于酵母菌的液体培养基稀释法(多量法与微量法)抗真菌药物敏感性试验方案M27-A，其中受试菌并不包括毛孢子菌，因此尽管临床上毛孢子菌病的发病率呈上升趋势，但是关于它们的抗真菌药物敏感性研究却十分有限。这种真菌引起的感染对于临床常见抗真菌药物的反应均不是很好应用两性霉素B以及氟康唑治疗失败的事件时有报道。我们应用M-27A方案对于所有试验菌株均进行了抗真菌药物药敏试验的摸索，结果证实，所有临床分离株对于临床常见的抗真菌药物如伊曲康唑、特比萘芬以及两性霉素B均不敏感，这与临床所见的常见抗真菌药物治疗效果不佳相一致。由于实验菌种以及菌株数量有限，而目前的相关研究较少栽们尚无法判定这是否为一种普遍的现象。与此同时，由于标准菌株对于伊曲康唑敏感，推测这种耐药现象的产生可能与临床菌株接触抗真菌药物相关，其耐药机制还有待于进一步研究。鉴于我们所得的实验数据以及临床的实际治疗状况，治疗严重深部感染患者时最好采用大剂量的联合治疗方案，尤其是使用不同作用机制的抗真菌药物进行联合同时注意提高患者的免疫力。

（责任编辑：叶惠玲）