RAPD技术应用中的问题

　　综述了RAPD技术的一些理论性问题，包括RAPD与其它分子标记技术相比的优点，影响结果重复性的因素，显性标记产生的原因，条带取舍的标准等。提出在实验中解决这些问题的一些方法：严格控制反应条件，采用单倍体和单剂量标记，系统学研究中要结合其它方法进行分析，定位基因时要选用合适的群体等。

　　1 RAPD技术原理及特点

　　1.1原理RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)，即随机扩增多态性DNA技术，是由美国科学家Wiliams和Welsh于1990年分别研究提出的，又称任意引物PCR。它的应用是基于这样的一个推理：对于同一模板DNA，用同一引物扩增既可能得到相同的带谱(模板基因组间可能具有同源性)，也可能得到不同的带谱。仅在某一特定模板中出现的条带就可作为该模板的分子标记。事实上，不同基因组DNA总是一定差异的，所以用RAPD就可以进行分子标记研究。理论上讲，在一定的扩增条件下，扩增的条带数取决于基因组的复杂性。对特定的引物，复杂性越高的基因组所产生的扩增条带数也越多。

　　90年代前期RAPD技术得到广泛的应用，几乎所有的作物都有这方面的研究报告。但随着研究的深入，人们发现该技术存在一定的缺陷，并对此作了一些探索。本文仅就RAPD技术的原理和应用中存在的理论性问题及一些改进措施的研究作一综述。

　　1.2 RPAD特点 与PCR相比，具有以下几个特点：①RAPD使用的是随机引物，不需要预先了解目的的基因和相应的序列。②操作简便，实验周期短，能在较短的时间筛选大量样品。③引物具有普遍适就性，适用于自动化操作分析。

　　与RFLP相比，具有以下特点：①RAPD分析只需要少量模板，一次扩增仅需20-100ng，这对于DNA量很少的材料进行基因组分析有利。比如对花粉粒、原生质体、种子等的DNA分析是切实可行的。②RAPD标记具有更大的随机性，亦有利于图谱的构建。对于DNA含量大的和多倍体物种，RFLP探针会与多倍体的多个片段杂交，所得到的混合指纹会对其它等位基因的阐明带来困难。而且由于DNA量较大，进行单拷贝的Southern杂交不很实际，至少需要很长的曝光时间，并且已知的探针数量有限。RAPD大大增加了可构建遗传图谱物种的数量。③无需借助于有伤害性的同位素，耗费的人力物力少。④灵敏度高。引物中的个别碱基的变化会引起扩增条带和强度的剧烈变化，这是RFLP所无法比拟的。⑤RAPD标记可以覆盖整个基因组，包括编码和非编码区，可以反映整个基因组的变化。⑥RAPD产物有大于50%的条带扩增于单拷贝区，经过克隆和序列分析后，可作为RFLP和原位杂交的探针，在基因定位、克隆及辅助选择育种中可以广泛应用。

　　2　RAPD技术本身存在的问题及对策

　　RAPD技术是由多种成分参加的生化反应，反应中各种成分均为微量，尽管其反应灵敏度高，但是影响因素较多，会出现重复性差等一些问题。为了得到较稳定的结果，各种反应参数必须事先优化选择，操作中每一步都必须小心谨慎，以防止出现差错。

　　2.1 温度 RAPD一般反应条件是：变性92-95℃，常用94℃，30-60s;延伸72℃，60-120s;退火35-37℃，30-60s。变性和延伸温度一般没有太大变化，而退火温度影响较大。退火温度低，引物和模板结合特异性较差，出现的条带可能增多;退火温度高，引物和模板结合特异性增加。有人提出，在寻找基因差异为目的的实验中，退火采用33-34℃效果更好。在优化方案中，退火温度可能要提高，以便降低背景，得到少而清晰的"带"。温度的梯度率也是十分重要的，特别是退火与延伸之间的梯度尤为重要。各种仪器的控温、升降温性能均有差别，一些仪器(如一些旧型号的仪器)在到达特定的温度前就开始计时，一些PCR仪显示的温度与实际温度会有差异。这些在设计程序和结果分析时有必要考虑，所以注明所用仪器的生产厂家、品牌、规格，就显得很有必要，对于同一批实验，注意控制在同样的温度条件下进行反应，结果才有可比性。

　　2.2反应物的影响 PCR扩增受多种成分的制约，产物仅在部分循环中呈指数式(2)增长，逐渐将达到一个平台期，模板是关键制约因素之一，RAPD产物取决于此，实验中非常精确的模板浓度是十分关键的一个步骤。浓度过低，分子碰撞机率低，偶然性大，扩增产物不稳定;浓度过高，会增加非专一性扩增产物。更重要的是，若循环数控制不好，引物过早消耗完，后面循环中，PCR扩增产物的3端会和原模板及每一次循环的扩增产物退火，造成不等长度的延伸。因此，如果原模板浓度过高，非专一性扩增产物就足以形成背景，这是高浓度模板造成弥散型产物的原因。相对而言，模板纯度影响不大，即反应液中蛋白质、多糖、RNA等大分子物质影响不大。理想的模板和引物浓度能产生多态性丰富、强弱带分明的RAPD图谱。引物3端的重要性似乎更大。此外，Mg+2浓度也影响反应的参数包括产物的特异性和引物二聚体的形成，人们在各自的实验中得出不同的结论，大约在1.5-4mmol/L范围内。总之，各种反应物的浓度应事先进行筛选优化。

　　2.3污染问题 实验中应设空白对照，因为引物、各种缓冲液和双蒸水都会造成污染。而且Taq酶也可能出现污染，给分析带来困难，所以必须设置对照以排除系统误差。并且，酶也尽可能优化。

　　2.4扩增条带的取舍 重复性问题 为了克服RAPD重复性差的问题，应设置重复实验。作为DNA多态性标记位点的条带是应该可重复的，重复性好是最重要的取舍指标，而带的强弱不应该作为取舍的指标。有学者认为带的强弱与其在基因组中的拷贝数有关。但据Thormann对十字花科植物分析，RAPD产物的强弱与该产物在基因组中的拷贝数无直接关系，而与引物及模板的同源性程度有关。分析一个位点时，要作全面分析，若某一个体的全部带均弱，其模板可能有问题(浓度、分子量);若某一个体的大部分带与其它个体强度一致，仅有一条或少数几条带弱，可能存在拷贝数差异。重复性不好的弱带(无规律出现的带)可能由非专一性扩增、产物间退火或其它人为因素造成，不能记录。

　　异源双链问题 Ayliffe研究亚麻锈病菌时发现F1代中出现的一条带在亲本中没有出现，进一步研究发现这一条带是由2个等位基因组成的异源双链形成的，这2个等位基因除中间插入的38bp的序列外，其余序列相同。这?a href="http://jbk.39.net/keshi/waike/gc/9d195.html " target="_blank" class=blue>痔醮梢栽诤蟠幸糯诟醚芯恐姓庵痔醮笤颊?.16%。在蜜蜂的研究中也发现了相似的问题，这种条带可以用单链核酸酶将其消除。也可以将电泳温度提高到60℃以上，使异源双链变性，以消除其影响。

　　非孟德尔遗传的条带 Heun等分析认为，在显示多态性的非模糊条带中有92.5%的表现为孟德尔显性遗传，其余的条带不符合孟德尔遗传，分析认为可能由不同的序列组成。一般实验中大多采用符合孟德尔遗传的条带进行分析。在连锁图谱分析中，基因型错误可以部分消除，即在F1代或1：1混合物中没有出现的条带，在其父母本中应尽可能去掉。

　　同一条带的同源性问题 Thormann将RAPD产物标记作探针，杂交结果表明，与探针片断迁移率一致的带有时并不同源，这种情况仅发生在种间。并比较了RFLP和RAPD标记在种内和种间得出的结果，发现RFLP和RAPD标记在种内水平的结果完全吻合，但在种以上等级的结果相差甚远，这说明在电泳结果的同一个带中，有可能存在序列不同但分子量相同的几条带，RAPD无法检测。这种可能在种内较少发生，而这种间可能性较大，Castagna用RFLP和RAPD比较研究也得出了相同的结论。

　　2.5电泳分辨率问题 电泳时，基因组不同位置的扩增产物共同移动的可能性是有的，即不同分子量的扩增产物可能在电泳时没有分开而形成一条带，凝胶分离系统和基因组的亲缘关系有可能提高这种概率。一般而言，聚丙烯酰胺和银染的分辨效果比琼脂糖和溴化乙铵要高，用较长(可达到20cm)或浓度更高(2%)的琼脂糖凝胶有助于提高分辨率。当然，随着分辨率和灵敏度的提高，更可能出现实验误差。所以有人评述：最保险而简单的方法是用琼脂糖电脉分离而且只注意那些无疑而重发性高的带。但是，聚丙烯酰胺和银染所揭示的高信息量的多态性无疑可加快分子标记的鉴定过程。

　　2.6显性标记问题 RAPD标记来自于模板DNA的复制，经过30一40次循环，扩增条带数量理论上可达2。原模板中扩增位点是纯合还是杂合已无法判断，因为纯合位点的扩增条带只相当于杂合位点的2倍，电泳时无法检测到其差别。杂交中。如果亲本一方为纯合体，F1代就可以全部表现出该条带;如为杂合体，该条带在F1中应为l：l分离，即一半后代有该条带，而另一半则没有。当然来自于多拷贝区的条带分析更为复杂。

（实习编辑：陈战锋）