血小板微粒及其临床应用

　　血小板微粒(Platelet Microparticle, PMP)是血小板在活化过程中释放的一种超微膜性囊泡。其直径小于0.5μm，不能用普通显微镜观察到其形态，不能用包括血小板计数仪在内的常规检测血小板的方法来检测。血小板微粒膜上携带有静息状态下血小板膜上的多数成分，也携带活化血小板膜上的标记物(如CD62p等)。它具有很强的促凝活性，也有一定的抗凝活性，在人体血栓与止血过程中发挥重要作用。

　　早在20世纪40年代人们就认识到血小板在凝血过程中的作用，因为乏血小板血浆的凝固时间要比富血小板血浆长很多[1]。但是，人们发现，往富血小板血浆中加入乏血小板血浆，可大大缩短其凝固时间;往乏血小板血浆中加入血清，其凝固时间甚至比富血小板血浆的凝固时间短[2]。1967年，Wolf首先发现并描述了血小板微粒，并对上述现象进行了解释：乏血小板血浆和血清中均存在血小板微粒，它具有很强的促凝活性[3]。后来，人们对血小板微粒的结构、形成、功能、检测方法及与临床疾病的关系进行了广泛的研究，现综述如下文。

　　一、血小板微粒的结构及生理特性

　　用电镜对血小板微粒进行研究，发现血小板微粒大小不等，其直径可小到0.02μm，但一般不大于0.5μm。静息状态下的血小板膜上表达的40多种糖蛋白，大多可在血小板微粒膜上表达;血小板膜上的许多活化标记物，如CD62p、CD63、暴露纤维蛋白原结合位点的GPⅡb/Ⅲa，也可在血小板微粒膜上表达[4,5,6]。但是，不同激活剂诱导形成的血小板微粒，膜上表达的糖蛋白有可能不同[7]。

　　人们研究发现，凝血酶和胶原激活血小板，其表达出的血小板激活因子(Platelet activating factor, PAF)活性源自血小板微粒[8]，而其它激活途径下的血小板释放的血小板激活因子也大部分与血小板微粒相关，所以血小板微粒具有很强的促凝活性，尤其是带β淀粉样前体蛋白的血小板微粒[9]。由于血小板激活因子在血栓、血小板减少症、炎症和过敏反应中起着重要作用，血小板激活因子受体拮抗剂有望成为新一代的抗血小板药物，所以血小板微粒对于抗血小板治疗研究具有重要价值。

　　血小板微粒不仅具有促凝活性，也参与人体的抗凝过程。Tans等研究证实，血小板微粒有促进活化蛋白C灭活活化Ⅴ因子的作用[10]。他们观察到，加入ADP或肾上腺素，活化蛋白C灭活活化Ⅴ因子的速度可加快4倍，加入凝血酶可加快11倍，加入胶原可加快29倍，加入A23187可加快60倍，而这种加速作用25%源自血小板微粒。Bode等人研究证实，血小板微粒可加强肝素的抗凝作用[11]。所以，不能简单地认为血小板微粒是一种血小板激活因子样的磷脂结构。人体内的血小板微粒不仅大小各异，形态结构不同，而且在生理特性上也有一定的差别，例如，并不是所有的血小板微粒都有促凝活性或抗凝活性，不同的血小板微粒促凝活性、抗凝活性不同。

　　另外，血小板微粒也参与细胞间的相互作用。Jy等人在研究白细胞与血小板相互作用时发现，血小板微粒可与中性粒细胞结合，并可在两个中性粒细胞之间充当连接体，使中性粒细胞连接成串珠状[12]。后来人们发现，血小板微粒可促进单核细胞与内皮细胞相互作用，刺激单核细胞分泌粘附分子 [13]。

　　二、血小板微粒的形成

　　研究证实，活化是血小板产生微粒的必需条件而非充分条件。体外研究血小板微粒的产生，必须先通过各种途径激活血小板。激活途径包括常规的血小板激活剂(肾上腺素、凝血酶、ADP、胶原、A23187等)、纤溶酶、补体C、抗血小板抗体、高剪切力等。当然，血小板微粒的形成是一个十分复杂的过程，其具体机理并不明确。

　　早在70年代，有学者用透射电镜观察到，相互粘附的血小板或被胶原激活的血小板形成伪足并释放出血小板微粒[14]。1982年，George等人发现，往血浆中加入凝血酶，产生大量的细胞微粒，他们用免疫电泳的方法证实这些微粒源自血小板，并用透射电镜观察到它们大小不等;他们还发现血清中血小板微粒的浓度大致是血浆中的10倍，这提示，凝血过程中伴随着大量血小板微粒的产生[15]。现已证实，大多数血小板激活剂，如肾上腺素、凝血酶、ADP、胶原、A23187等，均可诱发血小板微粒的形成，但它们诱导的效力不同[7,16,17]：肾上腺素

　　补体C是人体免疫系统的一个重要组成成分，但它与凝血系统、止血系统有密切联系。研究证实，在某些疾病中，补体C活化是血小板微粒形成增多的主要原因。在八十年代，人们研究发现补体C3a可直接导致血小板的活化，且与ADP有协同作用[19]，这也证实，血小板膜上存在补体C3a的特异性受体。在血栓性血小板减少性紫癜病人中，血小板与补体C3a结合大多与抗血小板抗体的存在有关。

　　1986年，Wiedmer等人用A23187、C5b-9在存在钙离子的情况下激活血小板，血小板释放出的微粒有丰富的凝血酶原激活物结合位点，这表明微粒具有很强的促凝活性[20,21]。他们还发现来自血小板α颗粒的活化Ⅴ因子，多半结合在血小板微粒膜上，因此，用C5b-9处理血小板所产生的微粒，促凝作用部分源自其活化Ⅴ因子的结合位点，因活化Ⅴ因子是凝血酶原激活物复合物的重要组成部分，故微粒可提供丰富的凝血酶原激活物结合位点。1991年他们进一步研究发现，用C5b-9处理血小板所产生的微粒上存在Ⅷ因子的结合位点[22]。他们还发现这种血小板微粒表面结合了大量的C5b-9，表达有丰富的GPⅠb、GMP140、GPⅡb/Ⅲa，但血小板微粒表面不表达活化的GPⅡb/Ⅲa(其上有纤维蛋白原结合位点)，虽然活化的血小板膜上表达[23]。他们还证实，用C5b-9激活血小板产生微粒需要钙离子参与[24]。

　　在正常的人体血循环中，血小板受到不同的剪切力的作用，从七十年代开始，人们也对剪切力对血小板的作用进行了广泛的研究[25,26]。人们用各种方法对血流形成剪切力，以观察血小板的活化情况，结果发现，剪切力作用下，血小板形成微粒的数量增加。剪切力作用下的血小板微粒形成，机制十分复杂，有多种血栓与止血因素参与，可能还与补体C的活化有关[27,28]。

　　三、血小板微粒的检测

　　从血小板微粒被发现至今，对血小板微粒的分析大致包括三个方面：血小板微粒的计数和定量、血小板微粒的相关功能活性分析(如促凝活性)、探讨血小板微粒可能存在的功能活性。下面介绍常见的血小板微粒分析—血小板微粒的计数和定量。

　　1. 测定无机磷的方法

　　许多早期的学者，通过测定含血小板微粒悬液中无机磷的含量，来推算磷脂的量，进而推算出血小板微粒的量。其采用的公式为：

　　1mmol 磷=1mmol 磷脂=774mg磷脂≈70%的血小板脂类[29]

　　这种方法非常不准确，而且十分繁琐，仅用于比较纯的血小板微粒悬液或者经反复洗涤后凝胶过滤的血小板悬液，否则其它细胞表面的磷脂将干扰其测定。

　　2. 使用放免标记的单抗的方法[30]

　　采用这种方法，一般要先将乏血小板血浆或血清超高速离心，并用缓冲液洗涤沉淀，然后用125I标记的抗微粒膜上相关蛋白(如GPⅠb、GPⅡb等)的抗体与微粒结合，再经洗涤，然后测定沉淀物的放射性，以推算血小板微粒的量。这种方法也比较繁琐，且有放射性污染物的产生，现在也较少使用。

　　3. 流式细胞仪的方法

　　流式细胞仪是研究血小板微粒的有力工具，可以说，近三十年来，正是由于流式细胞仪的使用，人们才对血小板微粒有了深入而广泛的认识。应用流式细胞仪分析血小板微粒，不仅操作简单，且可对其表达的蛋白进行准确的测定。

　　早期应用流式细胞仪分析血小板微粒，多采用大功率激光测定前向角(反应微粒大小)的方法[31]，这种方法较为粗糙，存在红细胞、白细胞源性微粒的干扰，但在正常健康人和血栓疾病患者血中血小板源性微粒占绝大多数(在90%以上)，所以这种方法在当时也是较准确的。后来由于免疫学和荧光标记技术的发展，人们制备了针对血小板膜糖蛋白的荧光标记抗体，如FITC标记的抗GPⅡb/Ⅲa (CD41a)单抗，并把它们应用到流式细胞仪测定血小板微粒上，排除了红细胞、白细胞源性微粒的干扰，大大提高了血小板微粒分析的准确性[32,33]。

　　现在的流式细胞仪激光功率虽已大为下降，它们还可以对大多数细胞进行分析，但使用这种流式细胞仪分析体积很小的血小板微粒，仅测量前向角是不够的。实验证实，如果仅用测定前向角的方法来测量血小板微粒，80%的血小板微粒将被遗漏。使用荧光标记的单克隆抗体就可弥补这一缺陷，它可以达到与大激光功率流式细胞仪一样的测定效果。以荧光标记的单克隆抗体分析血小板微粒的方法现已被广泛使用，使用的荧光素包括FITC、PE，使用的抗体包括抗CD41、抗CD42、抗CD61、抗CD62p等。

　　血小板微粒分析的另一个重要方面就是其绝对计数。如果对流式细胞仪的进样进行严格规定，如一定的时间、一定的速度，我们就可以对所分析样本中的血小板微粒进行准确的定量。另外，在测定样本中加入一定量的红细胞或其它微球，也可以用流式细胞仪对样本中的血小板微粒进行定量[34,35,36]。当然应用上述计数进行血小板微粒的绝对计数存在较大的室间差异，影响因素包括离心速度、荧光标记单抗、测定方法、血小板的激活途径等。

　　四、血小板微粒与临床疾病的关系

　　研究证实，血小板微粒在人体血栓与止血过程中起着重要作用，它与血栓与止血性疾病的发生、发展及预后、防治必然有密切的关系。临床上，人体血小板微粒数量上的变化，表现为减少和增多。血小板微粒减少，人体凝血功能缺陷;血小板微粒增多，导致人体高凝状态。

　　1. 血小板微粒减少

　　血小板微粒减少主要见于Scott综合征和Castaman缺陷。Scott综合征是一种罕见的出血性疾病，其血小板微粒形成障碍[17]。研究证实，所有的血小板激活剂均不能诱导其血小板微粒的形成，且伴有活化Ⅴ因子受体数量和功能上的缺陷。同时其红细胞也存在形成红细胞微粒的障碍[37]。Castaman缺陷是一种出血性疾病，出血时间延长，血小板微粒形成能力低下，同样的血小板激活剂，其形成量是正常人的18～25%[38]。它和Scott综合征不同，其凝血酶原活酶活性正常。虽然它同Scott综合征一样，血清中存在大量的凝血酶原，但加入磷脂后，其凝血酶原消耗实验可纠正。

　　2. 血小板微粒增多

　　人们首先报道血小板微粒增多的病例是免疫性血小板减少性紫癜[39]。1975年，有人用透射电镜在这类病人中发现了血小板微粒和红细胞微粒[40]，1991年有人用流式细胞仪对病人的血小板微粒进行了测定[40]，1992年免疫性血小板减少性紫癜病人血小板微粒增多这一现象获得了学术界的认可。我们知道血小板数量的多少有时并不能预示出血发生的几率，有些病人血小板多可能出血，有些病人血小板少不出血甚至有血栓形成的危险，这其中可能血小板微粒起作用的原因，然而，免疫性血小板减少性紫癜又是这一方面的特例，因为其血小板微粒增多却有出血倾向。免疫性血小板减少性紫癜病人血小板微粒增多的原因有待进一步探讨。

　　发生于小血管的短暂性缺血患者，血小板微粒明显升高。Lee等人曾对小血管脑中风和大血管脑中风患者的血小板微粒进行比较研究，发现小血管脑中风患者的血小板微粒浓度明显高于大血管脑中风患者，血小板微粒升高与小血管性脑中风明显相关[32]。

　　其它与血小板微粒升高相关的疾病还有：体外循环的患者、急性冠脉综合征、血中存在抗磷脂抗体的病人、药物诱发的血小板减少性紫癜、血栓性血小板减少性紫癜等。

　　活化血小板释放大量的微粒是它增加磷脂表面的一种有效方式，以便激活和集结促凝因子和抗凝因子，加速血小板活化局部的止血与血栓过程。血小板微粒在正常和病理止血过程中起着重要作用，广泛参与血栓形成、抗凝、白细胞粘附、血小板和内皮细胞的相互作用等过程，血小板微粒的研究，对止血与血栓性疾病的研究与防治具有重要价值。

（实习编辑：陈战锋）