血浆凝血酶原时间测定操作

　　一、项目名称：

　　血浆凝血酶原时间测定(prothrombin time ，PT)

　　二、检验方法名称：

　　凝结法

　　三、方法学原理：

　　在确定量的血浆样本经过一定时间的加温后，加入试剂。加入试剂后，采用波长为660nm的光照射样本。凝血过程(纤维蛋白原转化为纤维蛋白)中血的浑浊度可以通过测量散射光光强度的改变来测定。从散射光光强度的测定，可以做出凝血曲线，通过Percentage Detection Method法求得凝血时间。

　　四、方法学溯源：

　　凝血酶原时间(PT)测定是Quick于1935年创立的。在受检血浆中加入过量的组织凝血活酶(人脑、兔脑、胎盘及肺组织等制品的浸出液)和钙离子，使凝血酶原变为凝血酶，后者使纤维蛋白原转变为纤维蛋白。观察血浆凝固所需要的时间即凝血酶原时间。其凝固时间取决于凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅴ、Ⅹ、Ⅰ的水平。该试验是反映外源凝血系统最常用的筛选试验。

　　五、仪器：

　　(一)型号：Sysmex CA—1500自动血液凝血分析仪

　　(二)分析和计算参数：

　　1.处理量：约120个测试/小时

　　2.所需样本量：50μl

　　3.检验时间：在最长检验时间之内测出结果，典型最长检验时间：100秒

　　4.重复性：CV≤2%

　　5.计算参数：凝血酶原活动度(PT%)

　　凝血酶原比值(PT R)

　　国际标准化比值(INR)

　　六、试剂及配套品：

　　(一)试剂：

　　1. 凝血活酶含钙试剂(Thromborel® S)

　　(1)商标：德灵(DADE BEHRING)

　　(2)包装规格：Pack for 10×4ml

　　(3)代码：No.OUHP 29 , or

　　(4)参数：ISI(国际敏感度指数)=0.97

　　(5)成分：

　　1)Thromborel® S Reagent :

　　a. 冻干人胎盘促凝血酶原激酶(lyophilized human placental thromboplastin)

　　b. 氯化钙 (calcium chloride)

　　c. 稳定剂 (stabilizers)

　　2) 防腐剂(Preservatives):

　　a.庆大霉素(Gentamicin)(0.1g/L)

　　b. 5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(5-chloro-2-methyl-4-isothiazol-3-one and 2-methyl-4-isothiazol-3-one)(最大量 20mg/L)

　　2.佛罗那巴比妥缓冲液(Dade® Owren'S Veronal Buffer)

　　(1)商标：德灵(DADE BEHRING)

　　(2)包装规格：Pack for 10×10ml

　　(3)代码：B4234-25

　　(4)成分：

　　1)2.84×10­²M的巴比妥钠 (sodium barbital)

　　2)1.25×10­¹M的氯化钠 (sodium chloride)

　　3) PH 7.35±0.1

　　3. 清洗液(Cleaning)

　　2%次氯酸钠溶液(自配)

　　(二)配套品：

　　1.标准血浆(Standard Human Plasma)

　　(1) 商标：德灵(DADE BEHRING)

　　(2) 代码：No. ORKL

　　2.校准质控血浆(Ci-Trol®)

　　(1) 商标：德灵(DADE BEHRING)

　　(2) 代码：Level 1, B4244-10

　　Level 2, B4244-20

　　Level 3, B4244-30

　　3.质控血浆(Control Plasma)

　　(1) 商标：太平洋(Pacific Hemostasis)

　　(2) 代码及规格：Level 1 (Normal), 100595 10×1ml

　　Level 2 (Abnormal), 100596 10×1ml

　　Level 3 (Abnormal), 100597 10×1ml

　　七、操作步骤：

　　(一) 开机：开机前，先打开连机的打印机。按下机器右边的POWER按钮。开机后机器进行自检，当屏幕上边显示“Ready”时可以进行试验。

　　(二)洗针：在主屏幕上选“Rinse Probe”，然后按下“Execute”进行洗针。

　　(三)准备试剂：按照仪器试剂位置程序要求，把每一项的试剂准备好，放在相应的位置。(注：PT试剂的配制：在冻干粉试剂瓶中加入蒸馏水4ml，于37ºC温箱或水浴箱中放置30min)。

　　(四)准备标本：将室内质控和离心好的样本放在相应的样本架上(一个架子可放10个样本)，准备好放在进样器上。

　　(五)准备反应杯：打开仪器上盖装反应杯的盖子，查看反应杯是否够量，需及时添加。

　　(六)输入试验项目：按下主菜单上的“Work List”键，在试验项目键点击PT，使PT键由“—”变为“O”。如有需要按屏幕下的“Repeat”键，仪器会自动重复十个样本的检测项目与第一个样本相同。屏幕右边的光标移动键，按下“NEXT”表示翻到下一个界面，按“↑”表示向上移动光标，“←或→”表示下一个界面试验项目。

　　(七)输入样本号：按下“ID No.Entry”，按顺序输入样本的序号或病人的病历号。

　　(八)开始检测：待一切准备工作就绪，按下仪器右上角“START”键，仪器开始工作。

　　(九)查看结果：返回主屏幕，检测的项目如果由“◎”变为“●”表明此试验已经完成，然后按下“Stored Date”(储存结果)键，屏幕会换到结果显示界面，检测的结果会自动传输到此画面，如果查看反应趋势图，按下边第一个菜单“Graph”，查看凝集趋势、吸光度、结果等。

　　(十)洗针：当做完一批标本以后，需要洗针，按下“Rinse Probe”，然后按下“Execute”进行洗针。

　　(十一)关机：回到主屏幕下，在洗完针以后方可关机，切断电源，关闭打印机。

　　八、 参考范围：PT(sec)：11—14 s

　　PT% ：80%—120%

　　PT R ：1±0.15

　　INR ：0.8—1.5

　　九、 临床意义：

　　(一)PT延长

　　1.外源凝血系统的因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ和纤维蛋白原减低，如先天性某因子缺乏症和低(无)纤维蛋白原血症，但均很少见，获得性的见于DIC、原发性纤溶、维生素K缺乏症、肝脏疾病等。

　　2.血循环中抗凝物质增加，如肝素或FDP增多等。

　　(二)PT缩短 口服避孕药、高凝状态和血栓性疾病等。

　　(三)用于香豆素类等口服抗凝剂的监控

　　1.一般认为以维持PT值在参考值的2倍左右(1.3—2.5倍)即25—30s，或PT R为1.3—1.5(最大不超过2)为宜。

　　2.PT%应控制在40%以上，减低到40%有出血倾向。

　　3.不同情况下口服抗凝药治疗的最佳抗凝强度时INR的范围：

　　(1)术前两周或术中口服抗凝药，INR为1.5—3.0;

　　(2)原发或继发静脉血栓的预防，INR为2—3;

　　(3)活动性静脉血栓、肺梗塞、复发性静脉血栓的预防，INR为2—4;

　　(4)动脉血栓栓塞的预防，心脏换瓣术后，INR为3—4.5。

　　十、病人准备和标本要求：

　　(一)采血时，首先应该确认病人姓名，并且将姓名和编号写在真空采血管的标签处。

　　(二)尽可能保证每次采血都在同样的条件下进行，即病人处于休息状态，并且在早餐前采血。

　　(三)凝血实验标本最好不与其它实验一起采集，否则由于标本的分配、分装等而使血液停留在针管的时间延长。

　　(二)取血时，病人应松弛，环境温暖，防止静脉痉挛，止血带的压力应尽可能小，取血速度平稳顺利，防止产生气泡。，。

　　(三)用定量为3毫升的一次性枸橼酸钠(0.11mol/L)真空采血管采血至指定刻度，取血完毕立即轻轻颠倒混均混合均匀，不要剧烈震荡，并避免产生气泡。

　　(四)及时离心，3000转/分离心标本10分钟，以除去血小板。

　　(五)务必于采血后2小时内测定完毕,如不能完成试验，冷冻贮存少量血浆(0.5—1ml)(最好在-70℃，或者当贮存时间较短时，可以置于-20℃条件下)，在实验前将血浆于37℃下快速融化。血浆用塑料试管存放，并用塑料吸管移取标本。

　　十一、操作注意事项：

　　(一) 许多的实验误差都来源于技术的错误。在实验技术、试剂、温度及PH值上很小的变化都会导致试验结果明显的变化。孵育时间与温度是凝血酶原时间测定时应严格控制的参数。血浆绝不能在37°C下放置10min。

　　(二) 实验前应检查血浆是否有溶血、黄疸、脂血或出现凝块。

　　十二、编写者：

　　日 期：

　　十三、科主任签字：

（实习编辑：陈战锋）