39健康

免疫测定技术的发展趋势

  众所周知,现代免疫学的发展与微生物学尤其是细菌学是密不可分的,临床免疫测定技术的发展亦是如此。临床免疫检验技术的出现最早可追溯至十九世纪末。1896年,Widal发现在一定浓度的伤寒杆菌中加入伤寒病人的血清可致伤寒杆菌发生特异的凝集现象,利用这种凝集现象可有效的诊断伤寒病,这就是最早的用于病原体感染诊断的免疫凝集试验,亦即著名的肥达试验(Widal test)。该试验出现后,一百多年来一直用于临床检验。稍后,1897年Kraus又发现将细菌培养液与其相应的抗血清混合后可发生肉眼可见的沉淀反应,于是,免疫沉淀试验又应运而生。到1900年,维也纳大学病理解剖系的年仅32岁的助教Landsteiner发现一些人的血浆能使另一些人的红细胞凝集,这种同种凝集现象的发现,成为人类血型分类的基础,并由此而衍生了生物科学中的一个特殊分支即免疫血液学,Landsteiner也因人类血型的发现获得了1930年的诺贝尔生理学或医学奖。并且,直至今天,我们仍然在使用基本的红细胞凝集试验鉴定ABO血型。在同一年代,Bordet又发现了补体结合试验(Complement fixation test, CFT),即抗原抗体反应后具有补体结合的能力,如红细胞与溶血素反应后,如有补体存在即可出现溶血现象。因此,利用这种免疫溶血机制做指示系统,可以检测另一反应系统中抗原或抗体的存在与否。1906年Wassermann将这种试验用于梅毒螺旋体感染的诊断,建立了著名的用于梅毒血清学诊断的华氏反应。免疫沉淀和免疫凝集试验属于经典的免疫测定技术,现在仍常用的免疫沉淀试验有单向免疫扩散试验、双向免疫扩散试验、免疫电泳、免疫固定电泳、对流免疫电泳、火箭免疫电泳、免疫透射比浊、免疫散射比浊、免疫胶乳增强比浊等;常用免疫凝集试验有间接血凝试验、胶乳凝集试验和明胶颗粒凝集试验等。

  标记免疫测定技术标志着免疫测定技术进入到了高灵敏免疫测定的时代。1941年Coons等建立的荧光抗体技术(Fluorescent antibody technique)为定位组织和细胞中的抗原物质提供了一个直接而又有效的手段。在20世纪40年代以前,所出现免疫测定技术基本上都是定性或半定量测定方法,到50年代末60年代初,才出现完全的定量测定方法,即放射免疫试验(Radioimmnuoassay, RIA)。1960年,纽约退伍军人医院(the Veterans Administration Hospital)的Berson 和Yalow发表了内源性血浆胰岛素测定的RIA方法。高灵敏放免测定技术的出现,解决了以前难以测定的微量生物活性物质如激素的临床检测问题,其发明者之一Yalow 因此而获得了1977年的诺贝尔生理学或医学奖,Berson因为1972年就已去世,所以没能与Yalow一起分享这个荣誉。尽管放免测定技术的出现是免疫测定技术发展史上的一个里程碑,但由于其有试剂半衰期短,实验废液难以处理,污染环境等缺点,使得其现已逐步退出在临床常规检验中的应用,而采用非同位素标记物建立标记免疫测定技术成为发展主流。1966年,法国巴斯德研究所的Avrameas和Uriel以及美国的Nakane和Pierce同时报道了酶免疫测定技术。其将酶替代荧光素,用于抗原在组织中的定位,可通过光学显微镜和电子显微镜来观察。并且Avrameas报道了将酶通过戊二醛方法标记抗原和抗体的理想条件。60年代末,在酶免疫组织化学的基础上,瑞典斯德哥尔摩大学的Engvall和Perlmann、荷兰Organon公司的VanWeeman和Schuurs等以及法国巴斯德研究所的Avrameas等同时发展了一种酶标固相免疫测定技术,即酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)。Engvall和Perlmann以碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)作为标记物,建立兔血清IgG的定量ELISA测定方法。VanWeeman和Schuurs则以辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)作为标记物,建立定量检测人尿中hCG的ELISA方法。Avrameas等以酶标记抗原建立了血清IgG测定方法。这种简单方便的免疫测定技术出现后,不但成为了一种非常简便的研究工具,而且迅速地应用于各种生物活性物质及标志物的临床检测,并在临床应用中逐步取代了放免技术。其后,1972年Rubenstein等又建立了一种无需分离洗涤步骤的均相(Homogeneous)酶免疫测定技术—酶放大免疫分析技术(Enzyme multiplied immunoassay technique, EMIT),这种测定技术主要限于小分子物质如药物等的测定应用。随着70年代中期杂交瘤技术的发展,出现了单克隆抗体,其应用于免疫测定,极大地提高了免疫测定的灵敏度和特异性,且为不同免疫测定方法的设计提供了广阔的想象空间,各种免疫测定技术相继出现,如一步法双抗体夹心酶免疫测定,各种均相酶标或同位素标记免疫测定方法等。到了80年代,研究人员又发现胶体金可以作为抗体的标记物,建立简便快速的免疫渗滤层析试验,即所谓的金标试纸条。进入90年代,基于不同测定原理不同标记物(酶、发光物、元素化合物等)的各种自动化免疫分析仪,不断应用于临床检验,给我们实验室的日常工作,不但带来了很大的便利,而且其测定较之人工操作更为稳定和准确。自上世纪90年代以来,基因工程免疫测定试剂和基因工程抗体的发展,又一次拓宽了免疫测定技术的发展途径。

  综观免疫测定技术一百多年的发展历程,可以看出,这种建立在抗原和抗体特异相互作用基础上的临床检验技术,已成为我们认识了解生命未知物质的一个难以替代的手段,其发展的每一步都来自于相关学科研究认识的深入。如果说抗原和抗体特异相互作用,只是免疫测定技术的基本框架,那么标记物、单克隆抗体、固相支持物等等就像是这个框架上最丰富多彩的外装。

  常用的临床免疫检验项目主要可分为:(1)病原体抗原和抗体。如乙肝“两对半”(HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc)、抗-HBc IgM、抗-HAV IgM、丙型肝炎病毒抗体(抗-HCV)、人类免疫缺陷病毒抗体(抗-HIV)、梅毒抗体、风疹病毒抗体(IgM、IgG)、弓形虫抗体(IgM、IgG)、巨细胞病毒抗体(IgM、IgG)、单纯疱疹病毒抗体(IgM、IgG)等。(2)肿瘤标志。如甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异抗原(PSA)、CA19-9、CA125、CA15-3、CA50、CA72-4、CA242、鳞状上皮细胞癌抗原(SCC)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、组织多肽特异抗原(TPS)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)等。(3)特定蛋白。如C反应蛋白(CRP)、免疫球蛋白及亚类、补体C3和C4、抗链球溶血素O(ASO)、类风湿因子(RF)、前白蛋白(Prealbumin)、白蛋白(Albumin)、微白蛋白(Microalbumin)β2微球蛋白(β2Microglobulin)、α1抗胰蛋白酶 (α1AT)、铜蓝蛋白(Caeruloplasmin)、结合珠蛋白(Haptoglobin)、转铁蛋白 (Transferrin)、载脂蛋白A(APO-A1)、载脂蛋白B(APO-B)等。(4)激素。T3、T4、促甲状腺激素(TSH)、皮质醇(Cortisol)、卵泡刺激激素(FSH)、促黄体激素(LH)、孕酮、泌乳素(PRL)、睾酮、雌二醇、C-肽、胰岛素、肾上腺激素等。(5)自身抗体。如类风湿因子(RF)、抗环瓜氨酸肽抗体、抗核抗体、抗双链DNA抗体、抗ENA抗体、抗组蛋白抗体、抗核小体抗体、抗线粒体抗体、抗嗜中性粒细胞胞浆抗体(cANCA/pANCA)、抗甲状腺球蛋白抗体等。其他还有治疗药物监测(地高辛、苯妥英、茶碱、丙戊酸、卡马西平等)、肌钙蛋白等。

  在临床意义上,病原体抗原和抗体的检测主要是用于判断相应病原体的感染状态(急性或慢性感染、病原体携带等),一些如抗-HBs可用于疫苗免疫效果的判断。肿瘤标志由于没有很好的器官特异性,主要用于恶性肿瘤的治疗疗效、复发监测,一般不能用于健康体检肿瘤筛查和诊断,只有个别的项目如AFP、PSA可用于高危人群的健康体检。特定蛋白为血液中具有多种功能的蛋白,如载体蛋白、免疫球蛋白(抗体)、酶、凝血因子等,其含量变化通常与多种疾病有密切关系。如CRP是急性时相反应的一个极为灵敏的指标,血浆中CRP浓度在急性心肌梗死、创伤、感染、炎症、外科手术、肿癌浸润时迅速显著地增高,可达正常水平的2000倍。结合临床病史,有助于随访病程。有研究认为,CRP是引发心脏病的最强烈的危险因素,其危险程度是血液中过量胆固醇的2倍。CRP含量高的人患高血压的危险率比胆固醇高的人大1倍。如果炎症和过高的胆固醇同时出现的话,那么患心脏病和中风的危险率比正常的人要高出9倍。由此可见,CRP含量高和患心脏病呈正相关。此外有研究发现,血中高浓度的CRP是结肠癌发病的危险因素,并认为CRP可能是结肠癌的一个早期标志物。免疫球蛋白及其亚类浓度在不同年龄段有所差异,在某些疾病情况下,如慢性肝病、亚急性或慢性感染、结缔组织疾病、IgG骨髓瘤、无症状性单克隆IgG病、遗传性或获得性抗体缺乏症、混合性免疫缺陷综合症、选择性IgG缺乏症,蛋白丢失性肠病、肾病综合症、强直性肌营养不良,免疫抑制剂治疗儿童常见的反复呼吸道感染、经常腹泻、发育迟缓等症状以及经常发生的许多呼吸道疾病如中耳炎、鼻窦炎、肺炎、气管炎、慢性阻塞性肺疾病、支气管扩张以及哮喘等,这些指标的浓度将出现升高或降低,从而具有疾病诊断价值。补体含量下降并不一定代表免疫功能障碍或免疫缺陷,因为在缺血、凝固性坏死和中毒性坏死时,组织能释放较多的蛋白分解酶,导致补体溶血活度和补体组分的下降;血补体浓度升高,常见于各种炎症性疾病及阻塞性黄疸、急性心肌梗塞、溃疡性结肠炎、糖尿病、急性痛风、亚急性和急性甲状腺炎、急性风湿热、皮肌炎、多发性肌炎;混合性结缔组织病;结节性动脉周围炎等。其他特定蛋白的临床意义可参考相应专业书籍。激素测定中不同的激素指标则用于各种内分泌疾病的辅助诊断。如T3、T4和TSH用于甲状腺功能的辅助诊断;LH、FSH和TSH用于判断下丘脑-垂体-性腺轴功能;泌乳素升高则与垂体泌乳素瘤、垂体生长激素瘤、原发性肾上腺和甲状腺功能减退、肝病等有关,降低则与垂体前叶功能减退有关。其他激素测定的临床意义可参考相应专业书籍。自身抗体检测主要是用于自身免疫病诊断、疾病状态判断和疗效监测。

  《临床实验室》:现在广大临床工作者对免疫检验项目正常值的设立和质控存在疑惑,您对此有何见解?

  李教授:正常值又称“参考范围”,这个概念属于定量测定范畴。长期以来,我国临床定量测定(包括定量免疫测定)所使用的“参考范围”基本上源于国外教科书,是非黄种人的数据,从严格意义上说不适合于中国人群,但长期以来的使用并没出现大的问题,原因可能有两个:(1)绝大部分指标的“参考范围”在不同人种间的差异不大,再加上较大的“参考范围”,不会影响到临床医疗实践中临床医生的决策。(2)绝大部分定量检测指标其所具有的疾病诊断价值基本上处于辅助诊断的地位,其本身(单独一个指标)对疾病诊断并不具备决定性意义。在临床医学实践中,不管是实验室工作人员,还是临床医生,可能有很多对“参考范围”看得很重,其实之所以称之“参考范围”,其内在含义就是仅供“参考”,对于特定的患者来说,其某一个免疫检测指标的定量值是否正常,最重要是对其这个指标的长期的检测观察,比如说,某个人某个指标稍高于或稍低于“参考范围”,似乎不正常,但如果该人这个指标长期的检测值变化不大,则说明该个体的“正常值”要稍高于或稍低于人群的“参考范围”,其并无任何的疾病指示意义。所以临床检验的“正常值”,从某种意义上说,也是具有个体化特征的。

  关于免疫检验的室内质量控制,临床实验室工作人员常感到很困惑,不知从何做起。原因主要有以下几个:(1)ELISA测定的手工操作。现今临床生化检验基本上都使用全自动生化分析仪,仪器均带有质控作图软件,实验室工作人员基本上不用怎么费事即可完成质控任务。而免疫测定最为常用的ELISA多为手工操作,一般没有质控作图软件,需要实验室技术人员自己独立去绘制及确定判断失控的规则,所以难免会觉得有难度。(2)对室内质控的意义理解不够。可能有相当部分的实验室做室内质控,只是当做一件任务去完成,按规则在控即万事大吉,而缺乏对室内质控的定期充分分析,从分析中发现测定中可能存在的质量问题。(3)免疫测定的特点。免疫测定可分为定量和定性两类,对定量测定,采用生化检验常用的统计质控方法如L-J质控图方法,觉得比较容易理解。对定性测定,由于不同批试剂盒间对同一份质控样本的测定的S/CO值差异可能会较大,感到很难使用类似定量测定的L-J质控图方法,对“即刻法”了解不多,不知如何应用。(4)快速免疫测定如胶体金(硒)试纸条检测的质控问题。这种“床边”测定方法不需要采用室内质控品进行即时检测的室内质控,因为试纸条本身已有质控,如通常的“质控或对照线”。

  实际上,免疫测定,不管是定性还是定量,如采用统计学质控方法,同生化及其他检测是相通的,统计质控方法的基本依据是一件事情发生的概率,如一件发生概率很小(如<0.27%或5%)的事件发生,我们就将其视为有可能是测定错误所致(即视为失控),此时就需要分析原因,确定是否有错误发生,必要时对全部或部分样本进行重新检测。L-J质控图方法的13S规则,其内在统计学含义就是出现了概率<0.27%的事件,12S规则就是出现了概率<5%的事件,后者,显然假失控的概率太大,所以,我们通常将12S作为告警规则。限于篇幅,这里只是对有关质控问题进行一个简单的解释,具体可以参考相关的专业书籍,如《全国临床检验操作规程》(第三版)和《临床酶免疫测定技术》(李金明编著,人民军医出版社 2005)。

  《临床实验室》:免疫测定技术的临床应用发展最快、最具前途,请您介绍一下免疫测定技术的最新应用。

  李教授:在临床检验中,可以说免疫测定技术的应用非常广泛,这主要是因为免疫测定技术中的抗原和抗体的结合特点所致,换句话说,只要是能得到某物质的特异抗体,就可以建立该物质的免疫测定方法,反之亦然。所以,一些以前需要采用复杂的化学方法和物理方法如高效液相层析、色谱和质谱等检测的物质,现在有很多都可以使用简单价廉的免疫学方法检测,如糖化血红蛋白(HbA1c)、小分子药物和激素等。我们说,免疫测定技术很具有发展前景,与单克隆抗体技术、基因工程技术乃至物理学、化学和材料科学的发展是分不开的,也得益于其测定模式相互结合。如四代丙型肝炎病毒抗体(抗-HCV)测定ELISA方法的发展、可测出HBsAg变异体的ELISA试剂盒的出现、结合液相抗原抗体结合磁性微球固相分离的全自动免疫分析方法(较固相ELISA方法的测定时间大大缩短)、利用胶乳凝集增强敏感性的胶乳增强散射免疫比浊法、均相的克隆酶供体免疫测定(cloned enzymedonor immunoassay,CEDIA)、西门子公司的均相免疫测定方法发光氧通道试验(The luminescent oxygen channeling assay,LOCITM)、流式荧光免疫测定技术(Luminex,又称液相芯片)、蛋白芯片技术等。

  《临床实验室》:以上免疫测定技术与临床相结合时存在哪些难点?如何突破呢?

  李教授:免疫测定技术多种多样,免疫测定新技术仍层出不穷,以上免疫测定技术绝大部分都较为成熟,可以很好的用于临床实验室实际检测应用,一些免疫测定技术目前仅限于研究,如免疫PCR、纳米颗粒标记免疫技术、量子标记免疫测定技术以及一些免疫传感器等。免疫测定技术的发展,要做到可以在临床实验室常规实际应用,必须达到以下基本要求:(1)简便易行;(2)特异灵敏,结果准确;(3)有可重复性。在研发新的临床免疫测技术或方法前,不能只是追求“概念”新奇,使本来可采用简单方法解决的问题复杂化,以及一些只能用于科研的方法去尝试用于临床常规检测,如目前仍有很多人关注的一些蛋白芯片测定方法、蛋白质组学方法等。这些方法通常较常用常规方法复杂很多,最大的问题是通常没有可重复性,临床无法应用。因此,有关的试剂和/或仪器生产厂家,在将某种新的免疫测定技术用于临床检验前,首先要思考的一个问题是,新技术与现有方法之间相比,有什么样的优点,是更为简便快捷,还是更灵敏特异,以及试剂成本价格是否更低廉。其次要考虑的,就是这种技术或方法的成熟程度,也就是能不能实际应用。

  《临床实验室》:根据上述免疫测定技术的最新应用,您认为临床免疫检验的发展趋势是什么?

  李教授:免疫测定技术不存在落后和先进之分,经典的免疫沉淀和免疫凝集试验,我们至今乃至以后相当长的一段时间,都是临床实验室的常规免疫检验方法,有其独特的应用领域,如不需要高灵敏方法的体内含量较变的物质的测定,如特定蛋白、一些感染性疾病的抗体等。标记免疫测定技术的发展主要在于各种新标记物的出现,如纳米粒子标记、量子标记、荧光素及其淬灭剂标记(利用于荧光共振能量转移原理的均相免疫测定方法)等。随着抗体制备技术、基因工程技术、物理学、化学和材料科学的发展,临床免疫测定技术将不断发展,从可以准确预测来看,无疑是自动化,利用各种测定原理的全自动免疫分析仪将不断地用于临床检验,这是与临床检验要求结果准确、重复性好、操作简便、结果报告快速分不开的。

(实习编辑:陈战锋)

2009-12-08 04:38:00浏览44举报/反馈
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