感染性疾病血清学标志物检验质量保证

　　卫生部临床检验中心 李金明

　　一、定 义

　　• 质量保证( Quality Assurance,QA):为一产品或服务满足特定质量要求提供充分可信性所必要的有计划的和系统的措施。

　　• 室内质量控制( Internal Quality Control,IQC):由实验室工作人员,采取一定的方法和步骤，连续评价本实验室工作的可靠性程度，旨在监测和控制本实验室工作的精密度，提高本室常规工作中批内、批间样本检验的一致性，以确定测定结果是否可靠、可否发出报告的一项工作。

　　• 室间质量评价( External Quality Assessment, EQA ):为客观比较一实验室的测定结果与靶值的差异，由外单位机构，采取一定的办法，连续、客观地评价实验室的结果，发现误差并校正结果，使各实验室之间的结果具有可比性。这是对实验室操作和实验方法的回顾性评价，而不是用来决定在实时的测定结果的可接受性。当 EQA 用来为执业许可或实验室认证的目的而评价实验室操作时，常描述为实验室能力验证( Proficiency testing, PT )。在以前的文献中， EQA 常描述室间质量控制。

　　• 批( Run)：在相同条件下所获得的一组测定。

　　• 均值(Mean)

　　• 标准差(Standard deviation,SD或s)

　　• 变异系数(Coefficient of variation,CV)

　　• 正态分布(Gaussian distribution):当一质控物用同一方法在不同的时间重复多次测定，当测定数据足够多时，如以横轴表示测定值，纵轴表示在大量测定中相应测定值的个数，则可得到一个两头低，中间高，中为所有测定值的均值，左右对称的“ 钟形 ”曲线，亦即正态分布，又称高斯分布。

　　• 正态分布的基本统计学含义可用均数()、标准差(s)和概率来说明。

　　二、临床实验室常规检验步骤

　　(一)标本收集： 选择测定项目、标本收集和保存。

　　(二)实验室测定： 标本接收、贴标签、样本处理、检测、测定的有效性和临床诊疗价值。

　　(三)报告和解释： 结果发出、结果解释和临床管理。

　　(四)质量保证、室内质控和室间质评之间的关系

　　三、临床免疫检验方法

　　(一)三大“标记”免疫检验技术:荧光标记、放射性核素标记和酶标

　　(二)其它标记免疫测定技术：发光物标记、金标、元素标记等

　　(三)免疫沉淀和免疫凝集试验

　　四、感染性疾病血清学标志物

　　肝炎病毒标志物： HBsAg 、 抗 HCV 等、抗 HIV、梅毒抗体、其它抗原、抗体。

　　五、检验方法

　　1、ELISA

　　2、应用酶标原理的自动化分析仪

　　3、应用其它标记物的自动化分析仪

　　4、RIA

　　六、自动化免疫分析仪的基本原理

　　1、基本上均为固相免疫测定，固相以磁性微粒最为普遍，其次是聚丙烯微孔板条和试管。

　　2、均为标记免疫测定，标记物最常用的是酶(碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶)，其次是元素，发光标记物等;

　　3、通常采用发光或荧光测定方式(常使用的酶发光或荧光底物如 AMPPD ( Dioxetanes), 鲁米诺，4-甲基伞型酮磷酸盐等;

　　七、酶联免疫吸附试验( ELISA )

　　(一)影响 ELISA 测定的因素

　　1、试剂盒的因素

　　(1)实验操作

　　(2)影响 ELISA 试剂盒质量的因素

　　A、固相材料:聚苯乙烯塑料

　　B、抗原:纯化、合成和基因工程抗原

　　C、抗体：多抗、单抗和基因工程抗体

　　D、酶结合物：酶免疫测定的核心成份

　　E、色原底物： OPD 和 TMB

　　F、运输贮存

　　(二)酶免疫测定操作中的注意事项

　　1、标本的收集、运送和保存

　　A、标本类型及采集容器

　　a、最常用的标本：血液，包括血清、血浆和全血。唾液或尿液 。

　　b、建议采用真空采血管及蝶形针具，以免直接接触血液。采集容器最好为一次性无菌密闭容器。

　　B、标本采集时间及患者准备

　　a、激素和治疗药物：可的松峰值在早晨4～6点之间;生长激素、促黄体激素( LH ) 和促卵泡激素( FSH ) 均以阵发性方式释放，须在密切相连的时间间隔内采取数份血样本，以其中间值为测定值。又如当从卧位变为站立位时，血清中肾素活性将出现明显增高。再如治疗药物的检测，应根据药代动力学选择服药后的最适时间抽血检测。

　　b、感染性病原体抗原、抗体

　　c、肿瘤标志物

　　d、特定蛋白

　　C、可能影响测定结果的标本因素

　　a、内源性干扰因素：类风湿因子、补体、异嗜性抗体、治疗性抗体、自身抗体、溶菌酶、磷脂、药物小分子、总蛋白浓度等

　　b、外源性干扰因素：溶血、细菌污染、标本贮存时间过长、凝固不全、反复冻融

　　D、标本的保存

　　用于抗体检测的血清或血浆样品应存放于 -20℃ 以下， 短期(1周)内进行检测的样品可存放于2 -8℃ 。

　　2、试剂准备

　　(1)从冰箱中取出的试剂，待温度与室温平衡后使用;

　　(2)所用蒸馏水或去离子水应保证质量。

　　3、加样

　　(1)加样不可太快，避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。

　　(2)从滴瓶中滴加试剂，除了要注意滴加角度外，滴加速度也很重要，滴加太快，很容易出现重复滴加或加在两孔之间的现象，这样就会在孔内的非包被区出现非特异吸附，从而引起非特异显色。

　　(3)全自动加样系统的标本“交叉污染”问题

　　加样器

　　加样器的类型

　　(1)单道连续可调式移液器

　　(2)多通道连续可调式移液器

　　(3)单道连续移液器

　　(4)单道移液管配合使用的移液器

　　P 型移液器的型号和取液范围

　　(1)型号 所用量程范围( μ L )

　　(2)GILSON eppendorf

　　(3)P2 0.1 ? 2

　　(4)P10 0.5 ? 10 0.5 ? 10

　　(5)P20 2 ? 20 2 ? 20

　　(6)P100 20 ? 100 10 ? 100

　　(7)P200 30 ? 200 20 ? 200

　　(8)P1000 200 ? 1000 100 ? 1000

　　加样器的使用

　　吸液的位置

　　(1)把按钮压至第一停点垂直握持移液器，使吸嘴浸入液样中，浸入液体深度视型号而定：

　　(2)P2 和 P10 ≤ 1mm

　　(3)P20 和 P100 2 -3mm

　　(4)P200 和 P1000 2 -4mm

　　(5)P5000 3 -6mm

　　(6)P10ML 5 -7mm

　　P 型移液器的应用范围

　　(1)P2 ， P10 : 超微量计量及移液，应用于 DNA 定序及酶分析等。

　　(2)P20 ， P100 ， P200 和 P1000 应用于一般水溶液、酸、硷的计量和移液。

　　(3)P5000 和 P10ML 大体积移液和计量。

　　P 型移液器技术指标

　　加样器的校准

　　4、温育

　　(1)常采用的温育温度有 43℃ 、 37℃ 、室温和 4℃ 等。

　　(2)温育所需时间与温度成反比，即温育温度高，则所需时间相对较短。

　　(3)温育时，微孔板应置于水浴(浮于水面)或湿盒中，以使反应溶液的温度迅速与室温平衡。

　　(4)“边缘效应”的排除: 使用水浴或在将反应溶液加入至板孔中时，将板和溶液均加热至温育温度(如 37℃ )，就可以很容易地排除“边缘效应”，并且可提高测定的重复性。

　　5、洗板

　　(1)每次温育后洗板是否彻底，与非特异背景显色有很大关系。

　　(2)洗板液一般为含0.05% Tween20 的中性 PBS 。

　　(3)Tween20 为一种非离子去垢剂，既含亲水基团，也含疏水基团。

　　(4)洗涤作用机理，借助其疏水基团与固相上蛋白的疏水基团形成疏水键，从而削弱蛋白与固相的吸附，同时在其亲水基团与液相中水分子的结合作用下，促使蛋白质脱离固相而进入液相

　　(5)洗板液中 Tween20 浓度高于0.2%，可使包被于固相上的抗原或抗体解吸附而影响试验测定下限。

　　6、显色

　　(1) 加入底物 A 和 B 后，应振荡混匀

　　(2)当底物为 OPD 时，显色反应应避光进

　　(3) 一般商品试剂盒显色反应条件为 37℃ 或室温反应15～30 min 。 从理论上说， 37℃ 30分钟才可以使 HRP 的底物催化反应完全，尽管在最初的10分钟内，绝大部份催化反应即可完成。因此，为使弱阳性样本孔能有充分的显色，建议在 37℃ 下反应25～30分钟后，终止反应比色测定。

　　7、比色

　　(1) 加酸终止显色反应后，比色测定前应振荡混匀

　　(2) 测定时，要注意酶标仪的波长是否已调至合适

　　(3) 比较好的酶标仪可选择单波长或双波长比色测定，所谓双波长比色，即在敏感波长(此时对所显色具最大光吸收)如450 nm 和非敏感波长(所测得的光吸收为微孔板上的划痕、污迹以及指纹等所致)，最后从仪器得到的读数为在敏感波长测得的吸光度与非敏感波长测得的吸光度之差。

　　8、结果判断

　　(1) 按照试剂盒确定的 Cut-off 值判断结果

　　(2)ELISA 测定的“灰区”(可疑结果的含义)

　　9、结果报告及解释

　　(三)ELISA 测定的主要问题

　　1、酶免一步法的“ HOOK EFFECT” 问题

　　(1)一步法的“ HOOK EFFECT” 产生的原因： 定性酶免疫测定的 CUT-OFF 值

　　(2)酶免疫测定出现假阳性的原因

　　A、操作及仪器因素：加样、洗板、自动化加样系统的标本间“交叉污染”

　　B、标本因素： RF 、 补体、异嗜性抗体、动物抗体、动物抗体、高浓度 Ig 、 溶血、细菌污染、标本贮存时间过长、标本凝固不全

　　(3)酶免疫测定出现假阴性的原因

　　A、操作、试剂及仪器因素：标本未加、试剂过期或变质、仪器针孔堵塞、标本“交叉污染”

　　B、标本因素：补体、自身抗体、反复冻融

　　2、结果的判断

　　八、临床免疫检验的室内质控问题

　　1、临床免疫检验室内质控不太受重视的原因有三: 一方面可能是质控品来源有限或价格因素;其次是尚没有意识到;再有就是不知从何做起。

　　2、使用统一合格的校准品开展室内质控才是解决各实验室结果可比性差同时也是保证检验质量的唯一有效的途径 。

　　3、室内质控的内涵并不仅仅是使用质控物进行统计学质控，它包括分析前、分析中和分析后的质量控制三个方面。

　　4、免疫检验室内质控既有与临床生化室内质控共性的一面，也有其特性的地方

　　九、室内质量控制( IQC )

　　IQC 主要包括三个方面：

　　(1)测定前的质量控制;

　　(2)统计学质量控制;

　　(3)质量控制的评价 。

　　十、统计质控方法

　　(一)基线测定

　　(二)质控规则的表达方式及定义

　　1、 Levey-Jennings 质控图方法

　　基本的统计学含义：稳定条件下，在20个 IQC 结果中不应有多于1个结果超过2 SD ( 95.5% 可信限)限度;在1000个测定结果中超过3 SD ( 99.7% 可信限)的结果不多于3个。

　　如以±3 s 为失控限，假失控的概率为0.3%。

　　2、Levey-Jennings 质控图结合 Westgard 多规则质控方法

　　3、累积和 ( CUSUM) 质控方法

　　4、“即刻法”质控方法

　　“即刻法”质控方法的实质是一种统计学方法,即 Grubs 异常值取舍法;只要有3个以上的数据即可决定是否有异常值的存在。

　　十一、IQC 的局限性

　　1、在免疫测定中 IQC 可能测不出的误差

　　2、测定前 　　　　　　测定中　 　测定后

　　样本鉴定不对　 　　样本吸取不对 结果记录错误

　　样本贮存中变质　　 试剂加入不对

　　3、此类误差的发生率在不同的实验室有所不同，一般要求小于 0.1%，且应均衡地分布于测定前、测定中和测定后的不同阶段。

　　十二、室间质量评价( EQA )

　　1、EQA

　　2、Proficiency testing (PT)

　　十三、乙肝标志物检测的问题

　　乙肝“两对半”、抗 HBc IgM、HBV DNA

　　乙型肝炎病毒 ( Hepatitis B Virus )

　　乙肝“两对半”：乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝表面抗体(抗 HBs)、乙肝e抗原(HBeAg)、乙肝e抗体(抗 HBe)、乙肝核心抗体(抗 HBc)

　　(一)HBsAg 测定中可能存在的问题

　　1、在 HBsAg 的测定中，最大的问题是假阴性问题:

　　(1)HBsAg 含量低于所用方法的测定下限之下。如感染的“窗口期”、急性期后或恢复期、自限性感染末期的携带者等。

　　(2)编码 HBsAg 的 HBV S 基因的突变

　　(3)HCV/HDV 重叠感染对 HBV 复制和/或 HBsAg 的表达的抑制作用。

　　(4)测定方法所用抗体对 HBV 不同基因型检测敏感性的不同。

　　(5)HOOK EFFECT

　　2、编码 HBsAg 的 HBV S 基因的突变对检测的影响

　　(1)HBV 容易发生突变，较其他 DNA 病毒的突变率要高10倍

　　(2)突变主要集中在核心启动子、前核心区和编码病毒包膜蛋白的 a 决定簇的基因区域。

　　(二)目前的商品试剂盒对 HBsAg 突变株的测定能力

　　可归为三类：

　　1、突变 HBsAg 和野生型均可检出。

　　2、不能检出突变 HBsAg 。

　　3、与野生型抗原相比，突变 HBsAg 的检出能力明显降低。

　　使用酶标多克隆抗体的商品试剂，大多数可归为第一和第三类。

　　(三)HBV S 基因变异所致 HBsAg 假阴性的最大的问题

　　1、输血安全性。 尤其是逃逸突变株流行较广的地区，在 HBV 高流行区域，突变株的流行率也高

　　2、导致疫苗免疫的失败 。 要在进行人群 HBV 分子流行病学的基础上，考虑研制针对主要流行 HBsAg 变异株的乙肝疫苗，保证免疫的有效性。

　　(四)HBsAg 的变异所致的不常见的 HBV 标志物模式或不一致的结果。

　　1、单独抗 HBc 阳性。

　　2、HBsAg 阴性但 HBeAg 阳性。

　　3、血清 HBsAg 阴性但抗 HBc 和抗 HBs 阳性。

　　4、HBsAg ( HBeAg ) 和抗 HBs ( 大多为<100 IU/ml 的低滴度)同时存在。

　　5、使用不同厂家的 HBsAg 试剂盒得到的不一致结果。

　　(五)HBV 不同基因型对检测敏感性的影响

　　1、HBV 基因型依其全基因组大于8%的变化而分为八型，命名为 A 到 H 。 基因型 A 主要存在于白人，而基因 B 和 C 主要在亚洲人群。

　　2、以单抗为基础建立的 HBsAg 免疫测定方法，当用于生产单抗的病毒株与流行人群的亚型/基因型或变异株不同时，可能得不到可靠的结果

　　(六)总抗 HBc

　　1、机体对 HBV 抗原的免疫应答最早出现的是对 HBcAg 的细胞免疫应答，随后是体液免疫应答产生抗 HBc ， 总抗 HBc 包括抗 HBc IgM 、 IgA 、 IgG 和 IgE 等。

　　2、抗 HBc 不是保护性抗体。抗 HBc 在血中呈低滴度且与抗 HBs 同时存在，是既往感染的标志。

　　3、在 HBV 高流行人群中，抗 HBc 常作为疫苗免疫前的筛检方法。

　　3、在欧洲和美国，抗HBc还是血液筛查的一个指标。在我国，抗HBc没有作为血液筛查指标，其主要原因是抗HBc检测的假阳性导致血液废弃过多。

　　抗 HBc 测定方法：竞争 ELISA 模式

　　(七)抗 HBc 测定存在的最大问题

　　1、假阳性

　　2、单项抗 HBc 阳性结果的解释

　　(八)抗 HBc 测定假阳性的主要原因

　　1、血清(浆)中存在交叉反应性抗体或干扰性物质

　　2、一个主要原因：前母 B 淋巴细胞的非特异激活，导致未感染 HBV 的 IgA 或 IgM 相关分子的产生

　　(九)抗 HBc 检测特异性的改善

　　1、使用还原剂如二硫苏糖醇( dithiothreitol) 、 重亚硫酸钾( potassium bisulfite ) 和半胱氨酸等预处理血清标本

　　2、具有标本预处理的抗 HBc 试验的特异性在99.8%至99.9%之间。

　　3、在竞争性抗 HBc 免疫测定中，只有抑制值大于或等于90%者可考虑为真正的阳性

　　(十)单项抗 HBc 真阳性

　　1、常为 HBV DNA 阳性

　　2、常见于吸毒者、 HIV 感染者和 HBV/HCV 重叠感染者，在吸毒者中最高(>40%)，在妊娠妇女中单独抗 HBc 反应性的检出率为1.2%

　　(十一) 单项抗 HBc 阳性反应性的确认步骤

　　1、首先要确认测定结果的特异性，排除假阳性，可按下图中的步骤进行。

　　2、第二步是，如果单项抗 HBc 反应为真阳性，则应确定 HBV 感染阶段。单项抗 HBc 阳性一般见于 HBV 感染恢复期后(抗 HBs 消失或抗 HBs 浓度低)或在 HBsAg 清除期(携带末期)，此时， HBsAg 浓度处于最敏感 HBsAg 测定方法的测定下限之下(<0.15 ng/ml )。

　　3、少部份单项抗 HBc 阳性患者推测为自限性急性 HBV 感染的窗口期，此时， HBsAg 消失，几周后，抗 HBs 出现 。

　　十四、“对话”

　　(一)检验科与临床的对话

　　检验申请单的正确填写;标本的采集、运送、保存;检验方法的可靠性和局限性;检验结果的适当解释

　　(二)临床与检验科的对话

　　病人的临床诊断情况;所开检验项目用于诊疗的目的;标本采集的程序正确性;患者的其它检验项目情况

（实习编辑：陈战锋）