4种抗真菌药物的体外敏感性监测

　　研究氟康唑、伊曲康唑、两性霉素B、5-氟胞嘧啶对948株真菌的体外抗菌活性。方法：真菌收集自2004年1月至2005年4月于北京协和医院住院患者提供的标本。分别采用酵母菌纸片扩散法敏感试验，Mueller-Hinton琼脂中补充2%葡萄糖和0.5mg/L美蓝，其他操作类似于美国国家临床实验室标准委员会M2-A6细菌药敏试验法;以及ATB? FUNGUS 2敏感试验两种方法。结果：白念珠菌最常见，占59%，其次为热带念珠菌占15%，光滑念珠菌占13%，克柔念珠菌占2%，烟曲霉占2%和近平滑念珠菌占2%、四种药物对白念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌有较高的抗菌活性。结论：抗真菌药的类型不同，对不同种真菌的体外抗菌活性有较大的差异，伊曲康唑和氟康唑对所研究的酵母菌：白念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌有较好的体外抗菌活性。

　　[关键词]

　　抗真菌药;微生物敏感试验;真菌

　　真菌感染已成为白血病，淋巴瘤，免疫抑制，长期使用广谱抗生素，中心静脉插管，中性粒细胞减少，? 烧伤，低体重的早产儿，高APACHEⅡ积分，血液透析，骨髓或器官移植，胃肠道手术和机械通气等特殊人群的严重感染性疾病。过去临床对真菌感染的经验治疗主要选择三唑类利两性霉素B，但近10年真菌的种类发生了明显的变化，有高达77%的酵母菌菌血症是非白念珠菌引起的，它们对抗真菌药可以产生耐药性，酵母菌感染的治疗面临新的挑战[1，2]，因此，对威胁生命的真菌感染的患者，进行真菌药敏试验非常重要。为调查真菌对氟康唑、伊曲康唑、两性霉素B、5-氟胞嘧啶的敏感性，我们采用纸片扩散法和ATB FUNGUS 2两种方法测试948株真菌对氟康唑、伊曲康唑、两性霉素B、5-氟胞嘧啶的敏感性。

　　材料与方法

　　一、菌株来源

　　从2004年1月至2005年4月北京协和医院患者临床血液、尿液、胸腹水、脑脊液和下呼吸道标本中分离出可能致病的948株真菌。见表1、2。采用ChromG A显色培养基鉴定白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌及克柔念珠菌，其他念珠菌采用VITEK YBC卡鉴定到种的水平。

　　表1? 948株17种真菌所占百分比

　　菌株 株数(%)

　　白念珠菌57359

　　热带念珠菌14915

　　光滑念珠菌12613

　　克柔念珠菌222

　　烟曲霉222

　　近平滑念珠菌212

　　葡萄牙念珠菌111

　　黄曲霉71

　　新型隐球菌51

　　青霉属40

　　土曲霉20

　　季也蒙念珠菌10

　　念珠菌属10

　　无名念珠菌10

　　镰刀霉10

　　头状地霉10

　　酿酒酵母10

　　表2? 6种真菌在2004年-2005年的分离情况

　　真菌名 2004年1-12月2005年1-4月

　　白念株菌468104

　　热带念珠菌13315

　　光滑念珠菌9528

　　克柔念珠菌211

　　近平滑念珠菌139

　　烟曲霉202

　　二、抗真菌药

　　氟康唑，25μg/片，未开封的纸片-20℃保存，开封后冰箱保存4周。ATB FUNGUS 2试条，含有伊曲康唑、氟康唑、5-氟胞嘧啶和两性霉素B。

　　三、真菌药敏试验法

　　1.纸片扩散法敏感试验

　　采用2003年美国国家临床试验室标准委员会(NCCLS)建议的酵母菌纸片扩散法敏感试验指南，在Mueller-Hinton(MH)琼脂中补充2%葡萄糖和0.5mg/L美蓝[3]，在1L MH琼脂中，加入0.1ml美蓝(methyleneblue，Merck BP 1973产品)贮存液(0.1g美蓝加20ml无菌水即为美蓝贮存液)和20g葡萄糖。高压15min，121℃灭菌，水浴至55℃倾入4mm厚平皿备用。敏感试验其他操作步骤，与标准的细菌纸片法药敏试验相似，酵母菌悬液用无菌盐水比浊至0.5号麦氏管浊度，酵母菌量约为1×106～5×106/ml

　　2.ATB FUNGUS 2酵母菌敏感试验

　　ATB FUNGUS 2试条包括16对凹形杯。第一对不含任何抗真菌剂，用作阳性生长对照。另外的15对包含不同浓度的4种抗真菌剂，用于测定最小抑菌浓度(MIC)。将准备好的待测酵母菌的悬浮液转移到培养基中，并接种到试条上。孵肓后，通过肉眼判读凹形杯中液体的生长情况，获得MIC。试验条采用手工接种用ATB电子移液管混匀ATB F2培养基，避免产生气泡，使用ATB电子移液管在每个凹形杯中加入135μl的ATB F2培养基(大约3×104酵母菌/毫升或4×104酵母菌/凹形杯)。将一个盖子放在试条上，把试条放入一个密闭容器或是—个装有吸潮纸的GENbox型广口瓶里，在有氧条件下35℃(±2℃)的环境中，念珠菌属要培养24小时(±2小时)，新型隐球菌要培养48小时(±6小时)。对念珠菌属来说，如果在生长质控指示的凹形杯中生长不充分，24小时培养后，很难或是不可能读出试条的MIC，这时要在同样的环境下再培养24小时。

　　四、药敏指控

　　采用白念珠菌ATCC90028氟康唑可接受的抑菌环直径范围为28-39mm

　　五、结果判读

　　1.纸片扩散法敏感试验

　　读取抑菌环直径近似到mm，在大约80%抑制区判读为测量边界。在抑菌圈边缘或内部的极微小菌落(<20=可忽略不计，采用BIOMIC电子自动阅读系统读取抑菌环直径(mm)，并自动换算出相应的最低抑菌浓度(MIC)值(mg/L)[4]。氟康唑和5-氟胞嘧啶敏感性的解释标准见表3。

　　表3 氟康唑和5-氟胞嘧啶纸片扩散法的抑菌环直径和相应MIC的解释标准

　　抗真菌药 氟康唑氟康唑5-氟胞嘧啶

　　抑菌圈直径/mmMIC(mg.l/l)MIC(mg.l/l)

　　敏感(S)≥19≤8≤8

　　剂量依赖性敏感(SDD)15-1816-3216-32

　　耐药(R)≤14≥64≥64

　　2.ATB FUNGUS 2酵母菌敏感试验

　　通过肉眼判读或是使用ATB仪器自动判读来观察生长情况。为方便肉眼判读，把试条放在黑暗的背景下。对于每一个抗真菌制剂，从低浓度开始，与生长对照杯状凹比较，记录每一个杯状凹的生长得分见表4。对于两性霉素B，最小抑菌浓度(MIC)应该判断为省长完全受抑制的测试杯的浓度(即得分为“0”的测试杯)在杯状凹外围存在一个(或几个)散在的菌落或生长迹象，应记录为“1”分。对于氟康唑，伊曲康唑和5—氟胞嘧啶，鉴定可能存在拖尾生长，最小抑菌浓度(MIC)对应的测试杯得分可以是“2”，“1”，或是“0”分。且在杯状凹外围的生长迹象应记录为“0”或“1”分。[5]

　　表4.凹形杯的生长与得分

　　定义 得分

　　和生长对照完全一样4

　　比生长对照有轻微减少3

　　比生长对照孔明显减少2

　　非常微弱的生长1

　　没有生长0

　　六、数据分析

　　文中所得表格采用WHO耐药监测组提供的软件WHONET5.3分析所得。

　　结? 果

　　909株真菌对氟康唑、伊曲康唑、两性霉素B和5—氟胞嘧啶的药敏试验结果见表5。

　　菌株数<10株的菌种未参加分析，，表5显示采用纸片扩散法敏感试验结果：氟康唑对白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌的敏感性为23.8%～100%。采用ATB FUNGUS 2敏感性检测结果：其中热带念珠菌的MIC50为0.125～l，MIC90为0.5～1.6。

　　四种药物对白念珠菌、热带念珠菌有较高的抗菌活性。氟康唑对光滑念珠菌有较低的抗菌活性，其MIC50和MIC90范围明显高于两性霉素B和伊曲康唑，两性霉素B和伊曲康唑比氟康唑对这2种念珠菌有较高的抗菌活性。且伊曲康唑和两性霉素B对烟曲霉有较高的体外抗菌活性。

　　表5? 6种真菌对抗真菌药物的体外敏感性

　　真菌名株数抗真菌药耐药%中介%敏感%MIC50MIC90MIC平均值MIC范围

　　白念株菌468氟康唑*01.198.9

　　104氟康唑7.7092.30.540.7020.25-256

　　104伊曲康唑0.1250.50.1950.016-8

　　103两性霉素B0.50.50.4970.25-0.5

　　1045-氟胞嘧啶1.9097.10.50.50.5810.19-128

　　热带念珠菌 133氟康唑*0.80.898.5

　　15氟康唑6.76.786.71161.3820.25-128

　　15伊曲康唑0.12510.2390.125-4

　　15两性霉素B0.50.50.4770.25-0.5

　　155-氟胞嘧啶001000.50.50.50.5-0.5

　　光滑念珠菌 95氟康唑*12.63.284.2

　　27氟康唑7.418.574.14324.5480.25-512

　　26伊曲康唑0.540.50.125-8

　　26两性霉素B0.50.50.4620.016-1

　　285-氟胞嘧啶03.696.40.50.50.4430.032-32

　　克柔念珠菌21氟康唑*57.11923.8

　　1氟康唑64646464-64

　　1伊曲康唑0.50.50.50.5-0.5

　　1两性霉素B0.50.50.50.5-0.5

　　15-氟胞嘧啶2222-2

　　近平滑念株菌 13氟康唑*00100

　　8氟康唑0.580.7710.5-8

　　9伊曲康唑0.1250.50.1350.062-0.5

　　9两性霉素B0.50.50.4290.125-0.5

　　95-氟胞嘧啶0.50.50.3550.023-0.5

　　烟曲霉17伊曲康唑0.51.50.5880.19-2

　　18两性霉素B0.2560.3790.006-64

　　155-氟胞嘧啶1642.0140.032-64

　　讨论

　　本研究提示：氟康唑对白念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠闰有较高的抗菌活性。文献报道真菌血流感染自1980年的5.4%增加至1990年的9.9%，念珠菌菌血症的病死率为38%[6]。在美国流行病学研究发现，白念珠菌过去是最常见的念珠菌病的病原菌，但近来检测结果提示白念珠菌仅为55%，非白念珠菌为45%[6]对烟曲霉而言，伊曲康唑比两性霉素B有较低的MIC值，伊曲康唑对烟曲霉有较高的抗菌活性。对非白念珠菌中的光滑念珠菌和克柔念珠菌，伊曲康唑对光滑念珠菌的抗菌活性低于两性霉素B，氟康唑对这两种念珠菌显示出较高的耐药性，尤其对克柔念珠菌。本研究结果表明：抗真菌药的类型不同，对不同种真菌的体外抗菌活性有较大的差异，伊曲康唑和氟康唑对所研究的酵母菌：门念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌有较好的体外抗菌活性;伊曲康唑、两性霉素B对烟曲霉有较高的抗菌活性;氟康唑对克柔念珠菌和部分光滑念珠菌表现出较高的耐药性，但伊曲康唑试验株数较少，无法评估。

（实习编辑：陈战锋）