ELISA临床质量评价与质量管理

　　ELISA试剂的评价(evaluation)分两个方面：一是试剂本身的质量评价，符合一定要求后才能生产供应;一是在临床应 用中效果的评价。以肝炎ELISA诊断试剂为例，首先必须通过中国药品生物制品检定，以得到生产的许可。检定内容除包装、标签、 说明书等外，对试剂的性能，如特异性、灵敏度、精密度和线性等均需逐项检定，通过对一系列参比品的检测，结果符合要求者才为合格 。ELISA试剂的临床质量评价是用该试剂对临床样本进行检测，以观察其实际应用价值。部临检中心对乙肝ELISA诊断试剂在这 方面进行了工作，通过质量评价，促进了试剂质量的提高。

　　6.1　诊断试剂临床质量评价要点

　　从临床应用角度考核检验试剂的可靠性，是以其能否区分健康与疾病的能力作为依据的。目前还很难找到 100%可靠的试验，任何试验都会出现假阳性或假阴性。判断试验的可靠性常以其灵敏度及特异性作为考核标准。临床应用的灵敏度用 疾病患者试验阳性的百分率表示，特异性以无病者试验阴性的百分率表示。

　　进行这种评价，首先需要收集有关的病人血清，然后用公认的检测该项标志物最可靠的试剂进行测定，以确定其为阳性或阴性。

　　这一组表明测定物为阳性或阴性的血清组成"血清盘"(panel)。被评价的试剂测定此血清所得结果与血清盘标明的结果的关系如下表：

　　表中a为真阳性，b为假阳性，c为假阴性，d为真阴性。

　　被评价试剂的各项性能指标按以下分式计算：

　　灵敏度(%)=a/(a+c)×100%

　　特异性(%)=b/(b+d)×100%

　　符合率(%)=(a+d)/(a+b+c+d) ×100%

　　一般认为灵敏度或特异性>90%为良好。符合率是综合灵敏度和特异性的指标。

　　6.2　临床考核血清盘的制备要求

　　1、采用人的原血清;

　　2、 血清盘应具有相应的稳定性;

　　3、 血清盘中样本不含防腐剂，或只含极微量的、不影响检验结果的防腐剂;

　　4、 血清盘所包含的阴性样本和阳性样本约各占一半;

　　5、 阳性样本中，应有一定数量的强阳性和弱阳性样本;

　　6、 血清盘中应有一定数量的临界值上、下含量的样品，以检验试剂的灵敏度。

　　7、 血清盘中应包含与该项检验相关的病种样本和已积知具有干扰物质(RF因子)的样本，

　　以检验试剂的特异性。

　　6.3　临床考核血清盘的建议

　　以抗 -HBc-IgM为例，部临检中心收集近百例临床肝炎病人的样本，经美国abbott公司抗-HBc-IgM试剂反复检验筛选。 选出血清70份，其中阳性29份，阴性41份，组成抗-HBc-IgM临床考核血清盘。在70份样本中，除7份为无病历的质控血 清外，抗-HBc-IgM阳性的22份样本中含临床诊断急性肝炎16例、慢性活动性肝炎5例、重症肝炎1例;抗-HBc-IgM 阴性的40份样本中，含临床诊断慢性迁延性肝炎24例、急性肝炎例(均为恢复期采的血样)、慢性活动性肝炎8例(其中5例为恢复 血样)。

　　因此，这套抗血清盘用于商品试剂的临床考核，可以将临床上乙肝急性期、慢性活动期病人区分开，具有临床诊断意义。

　　质量管理

　　ELISA是一种敏感性高、特异性强、重复性好的实验诊断方法，由于其试剂稳定、易保存、操作简便、结果判断较客观等因素，以及 既适宜于大规模筛查试验又可以用于少量标本的检测，既可以做定性试验也可以做定量分析等优点，已广泛应用于微生物学、寄生虫学、 肿瘤学和细胞因子等领域。ELISA的影响因素较多，加强质量管理才能充分发挥其方法学的优点。

　　分析前质控

　　●人员培训 实验是人操作的，因此检验人员需经过培训，熟练掌握本专业如下几方面的技术知识：

　　◎检验项目的基本原理 (ELISA原理);

　　◎临床意义;

　　◎熟悉检测技巧，了解易出差错的环节及难点;

　　◎熟悉检测试剂性能(包括试剂盒组成，包被片段及其组成);

　　◎ 熟悉检测仪器的原理及性能;掌握数据处理的能力和质量控制知识。

　　◎某些特殊项目的检测如抗HIV等需经有关部门组织的专门培训班，考试合格后持证上岗。

　　分析前质控

　　◎ELISA原理：1971年Engvall等人把免疫组化的EIA技术应用于临床检验发展为ELISA技术。

　　特点 ：在固相表面组装免疫活性物质形成"免疫吸附剂"

　　酶标记免疫活性物质，进行信号放大;

　　有二步温育反应二次洗涤过程;

　　灵敏度特异性相对较高。

　　局限性：只能检测到ng水平

　　精密度差(批内CV15-20%);

　　线性范围窄(一个数量级);

　　存在"HD-HOOK"效应。

　　ELISA原理

　　●根据检测目的和操作步骤不同有三种基本方法。

　　●双抗体(原)夹心法 检测抗原(体)的常见方法，应用针对抗原两个不同决定族的两种单抗分别作为固相载 体和酶标抗体检测溶液中的抗原(适用于二价以上抗原,不能测小分子半抗原)。

　　●间接法 检测抗体的方法，利用酶标记的抗抗体(第二抗体)检测已与固相抗原结合的抗体。

　　●竞争法 检测抗原或小分子半抗原、抗体，以测抗原为例，使待测抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，结果 如待测抗原含量越多，与固相抗体结合的酶标抗原就越少，显色越浅，二者呈负相关。