深低温保存Rh阴性

　　目前国内冰冻红细胞常规解冻去甘油的方法多为手工制备，制备过程复杂，不易操作，常常由于人为原因导致红细胞制品的质量极不稳定(融化后的红细胞回收率只有60%左右)，进而影响疗效，甚至引起病人严重的输血不良反应。为了及时向临床提供Rh阴性血液，本中心于2005年4月开展了Rh阴性血液深低温保存，利用Mll5红细胞洗涤系统对冻存的Rh阴性红细胞进行解冻去甘油洗涤，通过1年的实践，终于制备出各项指标均达到国家规定质量标准的解冻红细胞，并已用于临床，输入效果良好。笔者对33U冰冻解冻去甘油红细胞进行了质量检测，现将质控及制备方法报告如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 仪器设备

　　CA 620全自动血细胞分析仪(瑞士MEDONIK)，722型分光光皮仪(上海第三仪器制造厂)，CR7离心机(日本HITACHI)，-80℃专用冰箱(美国)，无菌接口机(日本TERUMO)，M115洗涤系统(美国)。

　　1.2 方法

　　制备冰冻红细胞采用慢速冷冻法，用4℃保存6天内的Rh阴性全血或悬浮红细胞离心除去血浆的红细胞中加入57.1%(g/v)甘油为主要成分的红细胞冷冻保护剂，待红细胞甘油化后于-80℃专用冰箱冷冻保存，7天～350天后于39℃水浴解冻，参考美固FDA推荐方法并适当改进：第一次稀释：向血袋内注入9%NaCI溶液50ml，平衡2min;第二次稀释：向血袋注入0.9% NaCl 溶液100 ml，平衡2min;第三次稀释：向血袋注入0.9%NaCl溶液150 ml，平衡2min。然后，用M115型红细胞洗涤系统洗涤：注入0.9%NaC1溶液连续洗涤，当洗涤液颜色与制造商所提供的比色卡上“2”相当时洗涤完成。洗涤后用0.9%NaCl溶液悬浮红细胞。

　　1.3 质量检测

　　用血细胞分析仪检测红细胞、血红蛋白含量及洗涤前白细胞、血小板;Nageotte板检测洗涤后的白细胞数;细胞计数板检测洗涤后血小板;邻甲联苯胺法检测冰冻解冻去甘油红细胞上清液游离血红蛋白含量及体外溶血试验;采用磷酸甘油氧化酶 - 过氧化物酶(GPO—POD)法测定残余甘油含量。

　　2 结果

　　2.1 33袋冰冻解冻去甘油红细胞在光镜下观察细胞膜完整，表面呈现双凹状，无团聚现象。

　　2.2 红细胞回收率(%)80.24±6.19，甘油含量(g/L)3.79±0.88，游离血红蛋白(g/L)0.71±0.2. 3 解冻红细胞体外溶血(%)21.66±11.2。

　　3 讨论

　　Rh阴性血型在汉族人群中仅占2‰ 一5%，而血液常规保存有效期只有21—35天，因此，采集到的血液常因临床无需要而造成浪费，另一方面，临床紧急需要时，也可能因库存不足或偏型而造成供血困难，甚至延误临床急症抢救时间。所以，Rh阴性血液的深低温长期保存，对于血源、血液采集和供血的及时合理调配尤为重要。

　　根据质控结果，这些数据表明，利用Mll5红细胞洗涤系统，洗涤冰冻红细胞的方法是可行的，但需进一步改进以最大程度地减少红细胞的丢失。

　　影响红细胞回收率的原因分析：

　　红细胞甘油化是整个冷冻实验的关键。细胞对渗透压改变十分敏感，为使细胞承受能力在渗透压变化范围之内，就一定要掌握好甘油的注入速度。细胞充分甘油化后需要平衡一段时间，但时间延长会增加溶血，建议甘油化细胞平衡30分钟内冻存。与冰冻红细胞融化解冻的方法有关。我们认为融化冰冻红细胞的温度时间是关键，融化时水温过低，可再度形成冰晶，将会刺破红细胞膜而溶血，融化时水温过高时间过长可使红细胞膜的表面张力过度增高、破裂而溶血，我们认为融化冰冻红细胞的温度控制在39℃，时间不超过20分钟。与洗涤去甘油前加高渗盐的浓度有关。由于冰冻红细胞在融化后，红细胞处于高渗状态，所以必须先加入9%氯化钠溶液，使红细胞膜内外的渗透压达到平衡，再分两次加入0.9%氯化钠溶液，使红细胞膜内的渗透压由高渗呈梯度逐渐过渡到等渗后，再进行循环洗涤去甘油。通过实验说明该技术已完成Rh阴性稀有血液的保存以及解冻，并基本解决了本地区Rh阴性血液需求紧张的状况。

（实习编辑：陈战锋）