溶栓法对急性心梗者中性粒细胞表面补体含量的影响

　　免疫组织化学方法证实在梗死的心肌组织有膜攻击复合物C5b-9沉积[1]。急性心肌梗死患者血清中激活的补体片段浓度升高[2]。这些研究表明，急性心肌梗死伴随着补体系统的激活。近年来又发现溶栓治疗可以进一步激活急性心肌梗死患者的补体系统[3～6]。激活的补体系统至少通过两条途径损害心肌细胞[7]：一是复合物C5b-9结合并攻击心肌细胞膜;二是激活中性粒细胞和损伤血管内皮细胞引起再灌注损伤。但是，目前仍不清楚溶栓后补体系统的活化能否增加循环系统中性粒细胞表面的补体含量而引起中性粒细胞的激活。因此，我们应用免疫荧光技术和流式细胞术，测定急性心肌梗死患者静脉溶栓后沉积于中性粒细胞表面的补体片段C3c含量的动态变化。

　　方 法

　　一、病例选择

　　16例无明显心衰和心源性休克的急性心肌梗死患者(AMI组)，男14例，女2例，年龄(61±5)岁，胸痛至入院的时间为2～24 h(7 h±5 h)。急性心肌梗死的诊断依据是典型的临床表现，心电图出现新的异常Q波或ST段抬高以及心肌酶升高(CK大于正常上限2倍)。无溶栓禁忌证者在胸痛6 h内入院，或超过6 h但仍有明显胸痛或ST段显著抬高且相关导联有明显A波者给予溶栓治疗。6例用链激酶(SK 150万U/60 min)，4例用重组型纤溶酶原激活剂(r-TPA 50 mg/60 min)，6例用尿激酶(UK 100万～150万U/60 min)静脉溶栓。其他治疗包括阿司匹林、β阻滞剂、硝酸酯类和血管紧张素转化酶抑制剂等。三组患者均无感染、恶性肿瘤或自身免疫性疾病的证据。18例(男15例，女3例，年龄58岁±6岁)无器质性疾病的健康受试者作为对照组。急性心肌梗死患者在溶栓前，溶栓后30 min、60 min及120 min采静脉血2 mL。血标本置入EDTA抗凝管，30 min内用抗人C3c荧光抗体标记。

　　二、免疫荧光标记

　　用免疫荧光抗体标记中性粒细胞表面补体片段C3c的沉积。具体操作步骤如下：每次取抗凝全血30μL和等量NaN3-PBS加入三支玻璃试管，4℃红细胞裂解液5 mL溶解红细胞，低速离心，弃上清，NaN3-PBS冲洗细胞两次。细胞复悬于50μL NaN3-PBS，第一管加入FITC标记的兔抗人C3c单克隆抗体5μL(Dako)，第二管加入FITC/PE双色标记的鼠抗人CD45+CD14抗体5μL(Becton Dikinson)，第三管加入NaN3-PBS 5μL作空白对照。室温下暗室中孵育30 min，再用NaN3-PBS冲洗细胞两次，加1%多聚甲醛0.5 mL固定后置4℃冰箱保存，24 h内用流式细胞仪测定。

　　三、流式细胞术

　　Becton Dikinson FACS Calibur流式细胞仪测定中性粒细胞表面C3c的荧光强度。用空白对照和阴性对照消除自发荧光和非特异荧光的影响。根据细胞大小，细胞内颗粒密度，前散射(forward light scatter, FSC)和侧散射(side light scatter, SSC)将白细胞区分为淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞三个亚群，依CD45、CD14的荧光强度进一步证实三种白细胞亚群的纯度。圈出拟测定的细胞亚群，分析5000～10000个细胞。荧光信号以直方图或二维dot-plot散点图储存于电子计算机，自动分析每个细胞的平均荧光强度(mean fluorescence intensity, MFI)。

　　四、统计学处理

　　计量资料用Mean±SD表示。两样本均数比较采用t检验。多个样本均数比较方差齐时采用方差分析。P<0.05认为有统计学意义。所有数据输入电子计算机，用SPSS for Windows 7.5软件包进行分析。

（实习编辑：吴伟棋）