抗精子抗体的检测方法

　　在进行抗精子抗体检测之前，有几个基本概念需要说明。

　　（1）由于精子抗原的复杂性决定了相应抗体的多样性，试图用一种检测方法检出全部抗体是不可能的。

　　（2）随着生殖生物学和免疫学的进步，新的检测方法不断创立，至目前为止，抗精子抗体检测方法已有 10多种，应根据临床或研究目的、抗原定位以及与不孕、不育的关系等进行选择。

　　（3）目前，在众多检测方法中，没有一种是对不孕症完全特异的抗体检测法，因为与精子结合的抗体，不一定都能造成精子生物功能障碍。临床关注的是与不孕症呈因果关系的抗体。对这类抗体的检测，女方主要检查女性血清中与精子膜抗原发生反应的抗体，检测方法多用免疫珠法和 MAR 试验进行筛选，然后用精子制动化试验和体外受精阻断试验作进一步鉴定。男性方面，主要也是检查与精子膜抗原反应的抗体，除进行免疫珠检测、MAR 试验外，可以用凝集试验、制动化试验、受精阻断试验来确定抗体的生物学活动。

　　（4）抗精子抗体检测法的分类，当前还没有统一，但分类的原则主要是根据抗体的生物活性；抗体与活精子膜抗原的结合性和与精子及其提取抗原的反应性。有人分为 2 类，亦有人分为 3类。在此，引述 1993年繁田实采用的分类表供参考（表 9-1）。

　　表 9-1 抗精子抗体的检测方法

　　A.与精子及其提取抗原反应的抗体检测法

　　1.致敏血球凝集反应

　　2.间接荧光抗体法

　　3.放射性核素标记测定法

　　4.酶联免疫吸附法

　　B.与运动精子膜抗原结合的抗体检测法

　　1.检测与抗原结合性的方法

　　（1）免疫珠测定法

　　（2）混合抗球蛋白反应试验（MAR）

　　2.检测抗原结合性及抗体生物活性方法

　　（1）精子凝集试验

　　（2）精子制动化试验

　　（3）受精阻断试验

　　注：A 法以固定精子作抗原，适用于间接荧光法和 ELISA 法等。

　　B 法以活精子膜糖蛋白作抗原，适用于与膜抗原反应的抗体检查。

　　一、精子凝集试验

　　精子凝集试验从最初由 Kibrik等（1952年）创立的白明胶内精子凝集试验开始连同其后的发展，一共有 4 种：① 明胶凝集试验（Kibrik，1952）；② 试管玻片凝集试验（Franklin，Dukes，1964）；③ 毛 细 管 凝 集 试 验（Shulman，Hekman，Pann，1971）；④ 浅 盘 凝 集 试 验（Friberg，1974）。

　　（一）明胶凝集试验（gelatin agglutination test，GAT）

　　【准备】

　　（1）配制 Baker液（Bakersolution）

　　葡萄糖3.00gNa2HPO4·7H2O0.46g

　　NaCl0.20gKH2PO40.01g

　　加双蒸水至 100mL。

　　（2）用 Baker液配制 10% 白明胶溶液，并置 37℃ 水浴中备用。

　　（3）精子悬浮液：取正常新鲜精液（精子密度为 80×106/mL 左右，活动率 >60% ，a、b两级活动精子 >70% ），室温液化，用 Baker液稀释至 40×106/mL，置 37℃ 水浴中保存备用。

　　（4）待检血清及对照血清处理，均经 56℃ 水浴加热 30min，以灭活补体。随后用 Baker液，将两种血清均作 1∶4～ 1∶32倍数稀释，存放于 37℃ 水浴中备用。

　　【方法】

　　（1）取一定量的精子悬浮液，加入等量的 10% 明胶溶液，充分混合后，取 0.3mL 分别加入装有 0.3mL 对倍稀释血清的各支小试管内，并使其充分混合。

　　（2）将混合液分别用毛细吸管移置另一小试管（3mm ×30mm）内，37℃ 孵育 2h，移置 4℃放置 5min，待明胶凝固后，观察明胶内精子凝集情况，并判断结果。

　　【判断】

　　（1）阴性：精子在明胶内均匀分散，若以黑纸作背面对光观察，呈均匀乳白色，不见凝集块。

　　（2）阳性：精子成小凝集块，对光观察可见小凝集块有如雪花纷飞状，不难鉴别。

　　（3）抗体效价：以阳性反应的最高血清稀释倍数为血清凝集抗体效价。

　　（二）试管玻片凝集试验（又称为 F-D 法）

　　【准备】

　　（1）配制 Baker液（同上）或生理盐水。

　　（2）从患者血液中分离血清，经 56℃ 30min灭活补体处理，并以 Baker液或生理盐水把原血清作 1∶5稀释。

　　（3）精子悬浮液：取新鲜正常精液（同上）以 Baker液或生理盐水调整精子数为 4 ×106/mL。

　　【方法】

　　（1）取 0.25mL 处理后待检血清移置一小试管，加入 0.25mL 精子悬浮液。在另一小试管内加0.25mL Baker液或生理盐水，再加入 0.25mL 精子悬浮液作阴性对照。

　　（2）在 37℃ 条件下孵育 30min、60min、120min、240min，从小试管内分别取出一滴混合液放在载玻片上，加上盖玻片。

　　（3）在高倍镜下（400× ），观察精子凝集情况。

　　【判断】

　　阴性：未见精子凝集。

　　阳性：在 10个高倍视野下，有 5个以上视野出现 2个以上精子凝集者，判为阳性。

　　注：1991年张秀成对本法的操作略有变动：① 精子悬液，取新鲜精液后，用 Baker液洗3次，调精子浓度为 5×106/mL 供试验用；② 血清及精子悬液用量均为 0.1mL；③ 37℃ 孵育 1h；④ 有 3条精子以上凝集为阳性。

　　（三）毛细管凝集试验（sperm agglutination testin capillary tube）

　　【准备】

　　（1）配制 Baker液。

　　（2）制作精子悬浮液：把新鲜、正常、液化后的精液用 Baker液调整精子浓度为 40 ×106/mL。

　　（3）用 Baker液将灭活处理后的待检血清作对倍稀释。

　　（4）毛细管内径 1～ 2mm，长度 75～ 100mm，经清洁灭菌处理。

　　【方法】

　　（1）取一定量精子悬浮液与等量对倍稀释后待检血清混合。

　　（2）把混合液灌注入备用的毛细管内，两端用橡皮泥密封，直立于室温（20～ 25℃ ）温育1～ 2h后观察结果。

　　【判断】

　　（1）阴性：毛细管内呈均匀乳浊色。

　　（2）阳性：可见毛细管内有小凝集块。

　　（3）抗体效价：以阳性终点的血清稀释倍数为凝集效价。

　　注：凝集精子，若采用经 Baker液洗净的精子作悬浮液后效价可能提高。

　　（四）浅盘凝集试验（tray agglutination test，TAT）

　　【准备】

　　（1）配制 Baker液。

　　（2）用 Baker液配 10% BSA。

　　（3）洁净浅盘（或微量反应板）。

　　（4）精子悬浮液：将精液分装于 2～ 3支小试管内，其面叠加 10% BSA 0.5mL，放置 37℃1h，收集上层精子，用 Baker液调整精子浓度为 40×106/mL。

　　（5）将待检及对照血清作灭活补体处理（56℃ 30min），然后把血清进行 1∶4～ 1∶32对倍稀释。

　　【方法】

　　（1）浅盘孔上加液状石蜡覆盖，分别以微量加样器把 5μL血清及 1μL精子悬液注入浅盘孔的底部，并用小型振荡器使其充分混合。

　　（2）放 37℃ 1h或室温（25℃ ）4h温育。

　　（3）用倒置显微镜，观察结果。低倍镜（40× ，100× ）看凝集总体情况，高倍镜（200× ，400× ）观察凝集型。

　　【判断】

　　（1）阳性：1∶8以上血清稀释度有明显的精子凝集块。

　　（2）阴性：精子呈分散自由活动，无凝集块。

　　（3）凝集强度：精子全部或≥75% 凝集记" + + + "；

　　精子有≥50% 而≤75% 凝集，且有较大的凝集块记" + + "；

　　精子有≤50% 凝集，凝集块小而分散记" + "。

　　（五）改良浅盘法（改良 TAT 法）

　　【准备】

　　（1）配制 0.01mol/L pH 7.4磷酸缓冲液（PBS）。

　　（2）配制 0.01% 葡萄糖-PBS。

　　（3）以 Costar组织培养板（3696）代替浅盘。

　　（4）Hamilton微量注射器（50μL）型号 1705。

　　（5）待检血清在 37℃ 水浴中融化，并在 56℃ 30min作灭活处理。用 0.01% 葡萄糖-PBS把血清作 1∶16、1∶32、1∶64对倍稀释。

　　（6）精子悬液：新鲜液化精液首先通过玻璃棉过滤，以除去碎片和杂质块，并用 0.01%葡萄糖-PBS液调精子浓度为 40×106/mL。

　　【方法】

　　（1）每份稀释血清取 30μL加入 96孔 Costar组织培养板孔内，外周一行板孔不用，因外周一行板孔蒸发快，每孔再加入 3μL精子悬液。

　　（2）把培养板移入 37℃ 湿盒内，孵育 2h。

　　（3）用倒置显微镜的低倍镜（40× ，100× ）观察凝集程度，以高倍镜（200× ，400× ）观察凝集型。

　　【判断】

　　（1）精子有明显凝集为阳性，精子分散无凝集为阴性。

　　（2）凝集精子达≥75% 记" + + + "，凝集精子在≥50% 和≤75% 时记" + + "，凝集精子≤50% 时记" + "。

　　（3）血清效价：精子凝集至少在 1∶16 和 1∶32 两个稀释度出现时，才判血清抗体为（ + ），若只有一个稀释度出现凝集（如 1∶16），而 1∶32无凝集，则要重试 1∶8、1∶16、1∶32，抗体效价为出现凝集终点的血清稀释度。

　　（六）凝集试验的评价

　　（1）以上 4种凝集试验基本原理相同，方法不同，各有特点。其中以浅盘凝集试验敏感性最高，样品及精液用量少，既可定性、又可定量，还可以定型，适用于大量样品检查。

　　（2）精子凝集素属γ-球蛋白，可被洗净精子或精浆吸收，说明它是抗精子精浆抗体之一，但精子有非特异性自凝现象，类固醇激素引起的β-球蛋白以及样品中的支原体、衣原体、病毒等微生物都可能使精子出现凝集。因此，排除非特异性凝集现象是整个凝集试验的关键：① 每次试验应设立已知阴性和阳性血清作对照，凡对照不能确立，要重复试验。阴性对照成立表明实验结果可靠，阳性对照相符表明试验结果的敏感性和准确性。② 试验用精液需新鲜正常，待检血清不得污染，对照血清要作 100μL 分装置在 70℃ 保存，用时溶解。稀释液要新鲜配制。③ 待检血清开始用 1∶16、1∶32、1∶64三个稀释度筛选，3个稀释度均无凝集者判为阴性，2 个稀释度出现凝集判为阳性，1∶64 有凝集时，血清需往上稀释（1∶64、1∶256、1∶1024、1∶4096）重新测定，直至测出阳性终点为止。

　　（3）低效价的凝集素不一定是抗精子抗体，但高效价的精子凝集素肯定是抗精子抗体，而且与不孕症有关，因此临床上把血清效价在 1∶8以上者作为有诊断意义的界限。

　　（4）精子凝集类型大致有 4 种，即头对头、尾对尾、中段对中段和混合型等。有人认为头对头一般为 IgM，IgG；尾对尾、中段对中段则为 IgG。不过人们已注意到当抗体效价非常高时，在低稀释度显示的凝集类型与高稀释度的凝集类型不一样，如低度是混合型，而高度是头对头型。因此，通常的凝集活性以少于 30% ～ 50% 精子凝集时的稀释度作为滴度记录。

　　二、精子制动化试验（1968年 Isojim a等）

　　1968年 Isojima等人建立了依赖补体的精子制动化因子的检测方法，最初建立的是精子制动化半定量测定法，其后发展为定量测定法、微量测定法。1990 年辰已贤一等提出了简化的精子制动化试验。

　　（一）半定量精子制动化试验

　　【准备】

　　（1）精子悬浮液：取正常新鲜精液，置室温液化 20min，加入 3～ 4倍量 10% 灭活兔血清生理盐水，充分混合后以 1000r/min，5min离心，去上清，沉渣以 10% 兔血清生理盐水溶液10mL 造成混悬液，如此洗涤 2次，尽量除去精浆，第 2次洗涤后的精子沉淀，用 10% 兔血清生理盐水溶液调整精子浓度为 40×106/mL，或者就在沉渣上面轻轻加入适量的 10% 兔血清生理盐水，静置室温，让活动精子上游，收集上层精子，调整浓度为 40×106/mL 备用。

　　（2）阴性对照血清：取未婚妇女血清，经 56℃ 30min 灭活处理后，预作精子制动化检测，证明无精子制动作用，以 0.5mL 量分装于小试管内，置 - 20℃ 中冻结保存，临用前取出一支溶解备用。

　　（3）补体血清：采用市售或自己制备的豚鼠血清。

　　【方法】

　　（1）A 小试管（试验管）：加入灭活待检血清 0.25 mL，精子悬浮液 0.025 mL，补体0.05mL，充分混合后，置 32℃ 孵育 60min。

　　（2）B 小试管（对照管）：加入对照血清 0.25mL，精子悬浮液 0.025mL，补体 0.05mL，混合后作同上处理。

　　（3）C 小管（患者血清对照管）：目的是观察患者血清有无使精子出现非特异性制动作用。因此在 C 管中加入患者血清 0.25mL，精子悬浮液 0.025mL，但不加补体，混合后作同上处理。

　　（4）精子不动化值计算：孵育之后，分别从 A、B、C 管各取 1滴混悬液放在载玻片上，用显微镜（200～ 400× ）观察活动精子数，具体可观察 4个视野，每个视野数 50个精子，总数中求出运动精子的百分率，即精子的运动率（% ）。

　　【判断】

　　A 管的精子运动率为 T% ；B 管的精子运动率为 C% ；精子不动化值（sperm immobiliza-tion value，SIV）为 SIV =B 管 C%/A 管 T%=C/T≥2为阳性。

　　C 管只作为试验是否成立的判断，若 C 管出现制动作用，说明检体血清有非特异性制动作用，故试验不成立。