胚胎的冷冻保存

　　1983年，Trounson报道使用冷冻保存和融解的人类胚胎移植首例妊娠成功。此后冷冻保存胚胎用于辅助生育技术得以推广。1987 年之前 3 577 个胚胎用各种方法冷冻保存融解、移植，大约 50%（1 794个）融解后有存活力，其中 1 119个进行了胚胎移植。结果 163例获得妊娠（13.4% ），其中自然流产占 26% ，宫外孕 4% ，此外 2 例宫内及临产时诊断胎儿畸形。

　　首例活产的人类胚胎是用了不同于目前广泛使用的冷冻保存法。此例 胚 胎 系 用1.5mol/L的 DMSO 冷冻保存。在室温中将冷冻保存液浓度每隔 10min逐步增加。在培养液（PBS）中，DMSO 的初始浓度为 0.25mol/L，以后则逐步增加到 0.5、1.0 和 1.5mol/L 浓度。DMSO 浓度达到 1.5mol/L 后，培养剂中的胚胎以 2℃ /min的速率从室温冷却到 - 6℃ ，然后进行人工种植并在 -6℃ 保持 30min。试管再以 0.3℃ /min速率冷却到 - 80℃ ，然后放入液氮内（ -196℃ ）贮存。在融解时试管中胚胎从液氮中转移到 - 80℃ 控制箱，再以 8℃ /min速率融解到 +4℃ 。将 DMSO 逆向稀释。应用上述方法冻融处于 4-细胞或 8-细胞发育阶段的胚胎，则 68/136胚胎存活，其半数或多一些卵裂球保持完好。68个胚胎移植到 45个患者中后结果导致 9例临床妊娠。

　　一、用 DM SO 冷冻保存胚胎的方法

　　（1）胚胎放入冷冻玻璃瓶或管子内。

　　（2）胚胎从 +23℃ 开始，以 2℃ /min的速率冷却到 -6℃ 。

　　（3）种植并在 -6℃ 保持 10min。

　　（4）胚胎以 0.1℃ /min速率冷却到 -80℃ 。

　　（5）投入液氮内。

　　（6）在室温（ +23℃ ）下加入 DMSO，每隔 10min增加浓度 0.25mol/L，直到 1.5mol/L。

　　用 DMSO 冷冻保存卵裂胚胎而获临床妊娠的报道发表不久，Cohen等报道应用冷冻 /融解人类囊胚获得活产婴儿。该报道称体外受精获得的胚胎，受精后在人工环境内可放置4～ 7d。如囊胚继续发育，则将胚胎放进 Earl液中，在室温下加入甘油，经过 6 个不同的步骤，使甘油最后的浓度达到 8% ～ 10% 。然后将胚胎放进试管内，从室温开始以 1℃ /min速率降到 -7℃ ，进行手工种植。此后以 0.3℃ /min速率将试管冷却到 -36℃ ，然后投入液氮中。

　　二、囊胚冷冻保存步骤

　　（1）囊胚从 23℃ 起以 2℃ /分速率冷却到 -7℃ 。

　　（2）种植并保持 10min。

　　（3）以 0.3℃ /min速率冷却到 -30℃ 。

　　（4）投入液氮内。

　　胚胎融解时，则经历速融过程，即把试管从液氮中移入 30℃ 水浴。然后经逐步稀释除去甘油冷冻液，即培养基中甘油浓度逐步稀释从 8%（10min），6%（12min），5%（14min），4%（16min），3%（18min），2%（20min）到 1%（20min）。然后在新鲜培养基中冲洗和移植胚胎。在这第一组应用人囊胚进行的实验中，11 个患者接受胚胎移植后结果 2 例妊娠。Testart等报道用丙二醇（PROH）冷冻保存和贮存体外培养第 1 ～ 2 天的胚胎是一个有效方法。用PROH 冷冻液能保存发育到原核期、2-细胞期或 4-细胞期的胚胎。

　　三、用 PROH 冷冻保存胚胎的方法

　　（1）在室温下加入 0.5mol/L PROH，每隔 10min递增 0.5mol/L，直到 1.5mol/L。

　　（2）胚胎放入管中，在 HEPES-HTF 培养液内加入蔗糖，浓度为 0.2mol/L。

　　（3）胚胎以 2℃ /min速率冷却到 -7℃ 。

　　（4）在 -7℃ 下种植及维持 10min。

　　（5）胚胎以 0.3℃ /min速率冷却到 -30℃ 。

　　（6）投入液氮内。

　　最近 Cohen等还报道 47个胚胎移植周期应用 PROH 冷冻液，结果 12个妊娠，并认为适时融解和移植胚胎是提高临床效果的重要因素。有关资料证实胚胎融解要与自然周期同步。换言之，移植周期中 LH 峰提示开始排卵。在自然周期排卵后 3h内应同步融解胚胎。如果这种同步融解步骤超过了 3h妊娠均未成功。如果采卵周期中于排卵前 12h内采卵，而移植的胚胎也在排卵前 12h内融解，则妊娠率最高。在有的单位 PROH 最常用于早期胚胎冷冻，少数允许继续生长成囊胚的胚胎则用甘油作为冷冻液。用这种胚胎选择冷冻法，若胚胎在 2-细胞期或 4-细胞期未能确定其是否正常，可允许发育到囊胚形成，如它们能达到这个发育期，胚胎就可进行冷冻保存。目前认为如果胚胎显示正常发育，则胚胎应尽早冷冻保存。胚胎在体外培养的环境内时间越短，临床效果越佳。但是在某些情况下，若胚胎发育不规则，在冷冻前可让其发育到囊胚期，以证实冷冻胚胎是存活的。Trounson 与 Siobiom 最近报道了超速冷冻人类胚胎的可行性。用于放置胚胎的 Dolbecco磷酸盐缓冲液，含有 3mol/L的 DMSO 与 0.25mol/L 的蔗糖，并放在冷冻管内，管子是密封的，将胚胎于室温下置于含上述 DMSO 溶液的管子中持续 3min，然后直接投入 -196℃ 液氮中。胚胎融解时则直接从液氮移到 37℃ 水浴。超速冷冻的 22例胚胎中 18例完好存活。

（实习编辑：黄秀杰）