半透明带精子结合试验的操作程序

　　一、对照精液的获取

　　具有正常生育能力的男性对照者须符合以下条件：① 最近 2年内自然生育一个孩子；② 其精液常规检查参数在正常范围以内，活动精子≥60% ，精子浓度≥50× 106/mL，具有正常形态的精子≥50%（按 W HO 标准）。正常对照者精液应在禁欲 6d后应用手淫方法采集，并在射精后 15～ 60min内送到 HZA 技术员手中。

　　即使有生育力男性志愿者提供其精液作为对照，但其精液常规检查参数和 HZA 指数在每次测定中不可能相同。故最好通过测试其精子对于配对半透明带的结合率来选择 6～ 8名潜在的对照者。这样在标准 HZA 操作程序中可避免半透明带精子结合率持续低下（20～30个精子 /透明带）或过高（ > 120 个精子 /透明带），上述两种情况均会使患者的 HZA 指数值发生偏移。此外，为了避免 1～ 2名正常对照者提供对照精液，宜将 4～ 6名正常对照者的精液混合后使用。

　　二、HZA 精液标本的制备

　　制备 4～ 10mL HamsF10培养液，加 7.5% 的人胎脐带血清（或 3.5% 血清白蛋白）。这种培养液此后就称之为 Hams培养液。该培养液配制后，置于含 5% CO2的空气（37℃ ）中，均衡若干小时。此外在 37℃ 条件下也应使 25mL 重矿油达到气体均衡。

　　一旦获得了患者的精液，且已液化，则应准备对精液进行洗涤与"上游"处理。可以应用15 mL 的离心管分别盛放患者与正常对照者精液标本，事先应正确编号和标记。有人建议一天最多对 3名患者进行 HZA。如果患者精液中的精子浓度与活动力均合适，则两个试管中均加入 500μL 精液。反之，如果患者的活动精子比率甚低（ < 30% ）或精子浓度 < 15 ×106/mL，则每管加 250μL，直到把该患者的精液用完。至于正常对照者，则取双管即可，每管加 300μL 精液。然后每管再加入 0.5mL Hams培养液，以 400× g 离心 5～ 10min，然后弃上清液。上述各管中再加 0.5mL Hams培养液以混悬沉淀。再次离心 5min 后弃去上清液。对于正常对照者和精子活动力和浓度均正常的患者，在经上述 2次洗涤后的每个精液沉淀管内加入 0.5mL Hams培养液。而对于精液质量较差者，同样需要在其每个精液沉淀管中加入 0.5mL Hams培养液。

　　所有样品管加上盖子后，同时在 37℃ 、含 5% CO2的空气中温育 1h，以利于精子"上游"。然后把这些样品管从温育箱中轻轻取出，从每个对象的样品管中轻轻吸取上清液后混在一起。这一操作步骤至关重要，如果搅动了各样品管下的沉淀，会使无活动的精子上游至上清液中。接着计算对照者和患者精液的活动精子百分比和精子浓度。可用标准血球计数器和玻片分别计算上述两个参数，也可依靠从电脑辅助的精子分析仪获得的数据进行计算。然后再计算活动精子的浓度（即每毫升中活动精子数，以 M 表示）。

　　在此基础上制备 1mL 经稀释的精子上清液，用以加入 HZA 培养皿中。所需活动精子的精子上清液μL数 x可应用以下公式计算：

　　0.5/M = x/1000μL；xμL=500/M

　　将每个对象的精液经上游技术处理后的上清液混合，吸取由上述公式计算的 xμL，再加 Hams培养液至 1mL 即可。

　　无论是正常对照者，还是患者，其精子上清液的活动精子浓度必须非常接近5×106/mL，这一点对于 HZA 甚为重要。故为 HZA 共培养而制备的 1mL 精子上清液稀释好以后，可在血球计数器的计数池中直接加一滴以核对活动精子的浓度是否为 5×106/mL 左右。因为在浓度太低的情况下，如利用电脑辅助的计数仪核对活动精子浓度可能会使结果不准确。若对照者与患者的上清液活动精子浓度相差 15% 以上，则应根据计算结果将适量的未稀释的相应上清液加入其已稀释的浓度过低的制备样品中。如果核对后发现患者的上游后样品的上清液所含活动精 < 5× 106/mL，则可通过慢速离心（300× g，5min），使上清液精子浓度提高，或使拟放入半透明带培养皿中的患者精子和对照者精子均稍减少一些，但在作 HZA 时，活动精子的浓度无论如何不能低于 2.5×106/mL。

　　如果高度怀疑某 IVF 患者的精子的受精能力，或因为第一次 HZA 未能成功而正在进行第二次 HZA 时，则可采用一种改良方法开展此项试验。即应用对照者精子（5× 106/mL）进行标准的半透明带受精，而应用患者精子进行 HZA 时，可采用比较高的浓度。如果对于某患者进行 IVF 时拟采用的精子浓度为常规方法的 10倍，则在作 HZA 时，也可用相同浓度的精子样品即 5×106/mL。其 HZAI若能超过 65，增加受精时的精子浓度即可使患者体外受精能力随之增加。当然如果要评估患者体内受精能力，则加入半透明带培养皿中的正常对照者的上清液精子浓度也应与患者的相同。

　　在患者要进行 HZA 的当天，必须有一现成的半透明带。在即将盛放半透明带的每个玻璃皿（10mm ×35mm）底部分别写上对照者编码和患者姓名和半透明带编号。吸取一滴（约100μL）已稀释的对照者或患者的精子（5×106/mL）加至相应的玻璃皿中央，并立即用温度为37℃ 的矿物油覆盖其上。用解剖显微镜大致检查一下加入玻璃皿中的患者和对照者的上清液，以保证两者精子浓度基本相等。然后将两个配对的半透明带分别加入患者和对照者的精液滴中。

　　在 37℃ ，含 5% CO2的空气条件下，将上述玻璃皿温育 4h。半透明带与精子经共培养后即随玻璃皿带至解剖显微镜载物台上以备漂洗。在一个清洁平皿中加入若干冷的漂洗培养液（因为冷休克可使精子活动速度减慢），有利于计数，特别是在半透明带结合了大量精子的情况下。取一根吸管，其吸嘴开口的直径约为半透明带直径的 1.5倍，将经温育的结合有精子的半透明带从培养皿中吸到上述的漂洗培养液中。再用此吸管将半透明带用力反复抽吸 5次以洗去松散附着于半透明带表面的精子，然后把该半透明带放置于被矿物油覆盖的上清液培养液中以计算结合于半透明带的精子数。每个经共培养的半透明带均按此程序进行洗涤。但盛放半透明带的培养皿必须有相应标记，以免报告结果时张冠李戴。

　　用同样的吸管把盛放准备计数的半透明带的玻璃皿转移至倒置显微镜载物台上。用清洁的 25号针头轻轻推拨，翻转半透明带以便能看清半透明带凸面。经过练习，就可以依次由半透明带凸面到凹面，由顶部往下计算其结合的精子数。也可根据自己的习惯，按一定顺序进行计数，然后根据上述公式计算 HZAI。

（实习编辑：黄秀杰）