副溶血性弧菌食物中毒诊断技术

　　(一)检验方法

　　1.样品采集

　　以无菌方法采取具代表性的样品，置灭菌的容器内。一般采集患者粪便、呕吐物和中毒的可疑原因食品。常见可疑的食品有鱼、虾、蟹、贝等海产品及其他有关的食品。若上述食品均为煮熟品，也可检验它们的包装物、烹调用具等。

　　副溶血弧菌不宜在低温环境中生存，故采集到的样品应尽快送往实验室，不宜冷冻保存运送，以免影响检验结果。

　　2.分离培养

　　副溶血弧菌营养要求不高，普通培养基、蛋白胨水中均可生长。在含盐3.5%的培养基上生长良好，0.5%盐时可生长，12%以上及无盐的培养基中不能生长。发育温度为30-37~C，以37~C最佳。生长的pH范围是7.0-9.5，最适pH为7.7～8.0，需氧性强，厌氧生长很缓慢。多数菌株于肉汤、蛋白胨水等培养基中呈浑浊表面形成菌膜。R型菌发生沉淀。厌氧培养48h以上，才见生长。固体培养基上菌落常呈圆形隆起，不透明，表面光滑、湿润，多数菌株继代后，呈不正圆。粗糙型菌落，灰白半透明或不透明，在EMB琼脂上不生长。某些菌株在麦康凯培养基上不生长;生长者，其菌落为圆形、平坦、半透明或浑浊略带红色。从腹泻病例初次分离到的菌落多较典型一般不形成色素。食品中分离到的菌株，多为R型。胆酸盐稍有阻止该菌扩散的作用，血平板上可见溶血环。在氯化钠蔗糖平板上菌落呈绿色。S.S琼脂上菌落中等大，无色透明、扁平、有动性，不易被接种环挑起。 该菌对乙酸，90%以上菌株对0/129抑制弧2，4-二氨基-6，7-二异丙基喋啶)敏感。该菌的溶血作用是因其具有耐热性溶血素，这种溶血素是相对分子质量约为42000的酸性蛋白质，对心脏有毒性，是一种即时型致死毒。

　　(二)动物试验

　　经上述试验符合副溶血性弧菌的菌株接种于3.5%NaCl蛋白胨水中，经16-18h培养后，小鼠腹腔注射0.3ml，观察2-3天。小鼠症状为竖毛，不活泼，食欲不振，腹部贴饲养罐底，呼吸困难，步态蹒跚有时呈痉挛性跳动、四肢抽搐及尾部痉挛性振动，多于24-48h内死亡，将死亡小鼠作剖检与分离培养。

　　(三)患者血清凝集试验

　　从患者分离的S型菌株，接种于3.5%食盐的琼脂斜面，37C培养24h，以无菌生理盐水洗下稀释成每毫升含菌10亿个的菌液沸水煮1h，加入0.5%苯酚即成O抗原。将其与患者血清作试管凝集试验：血清稀释为(1：10)～(1：640)，于37~C过夜，观察。凝集价在(1：80)一(1：160)为阳性，1：40为可疑。通常发病10天后凝集价开始下降。

　　(四) KP溶血试验

　　副溶血性弧菌临床分离株绝大部分都能产生耐热直接溶血毒素(thermostable direct hemolysin，TDH)，并能在鲜血平板上产生一种特殊的溶血现象，叫做神奈川现象(kanawaga phenomenen，KP)。该试验需经过前增菌、选择性增菌、选择性培养后，挑取可疑菌落接种到鲜血平板上，置于37℃孵箱中过夜，如菌苔周围出现透明溶血环，即为KP阳性，据此诊断样本中含有Vp。该试验是检测副溶血性弧菌最基本的方法，能把绝大部分副溶血性弧菌检测出来，但操作烦琐、所需时间长(约4天)，而且存在部分TDH-株，易漏检，给人们健康带来危害。

（实习编辑：王哲君）