孕期食品安全和营养仍然是重要问题，孕期母体营养可能对后代发育，尤其是大脑发育产生深远影响。怀孕期间营养不良、酗酒和其他不安全的饮食会损害大脑发育。然而，很少有深入的研究分析母体营养对胎儿大脑发育的影响。本研究检查了怀孕期间暴露于不安全的母体饮食对后代大脑发育的影响，并试图减少潜在的不利影响。
亚硝酸盐天然存在于食物链中，亚硝酸钠和亚硝酸钾是常用的食品添加剂 。据报道，妊娠后半期饮水中摄入2g/L亚硝酸钠会损害后代的学习能力，这可能与亚硝酸钠的神经毒性有关。本研究探讨了亚硝酸钠对胎鼠大脑发育的影响。Omega-3 多不饱和脂肪酸 (PUFA ω-3) 被广泛认为会影响胎儿和婴儿的神经发育。PUFA ω-3 对于大脑发育以及预防和治疗行为、情绪和其他脑部疾病是必不可少的。此外，富含 PUFA ω-3 的饮食可以提供有益的抗炎作用。然而，PUFA ω-3 对妊娠期间亚硝酸钠暴露引起的胎儿脑发育不良的影响尚未见报道。
本研究首先通过检查大鼠胎儿胎盘和大脑皮层组织的炎症和氧化应激来研究暴露于不同浓度亚硝酸钠对怀孕大鼠的影响。接下来，使用适当浓度的亚硝酸钠构建胎鼠脑损伤模型。然后将 PUFA w-3 添加到怀孕大鼠的饮食中。随后，检查了 PUFA ω-3 是否可以减轻外源性亚硝酸钠诱导的胎儿脑损伤和可能的潜在途径。
1.妊娠期暴露于亚硝酸钠会引起炎症和氧化应激
给妊娠大鼠喂食不同浓度的亚硝酸钠，采集外周血测定NOO-和NO浓度。与对照组相比，低、中、高剂量组NOO-和NO浓度显著增加，且呈剂量依赖性（图1A和1B）。然后通过评估TNF、NOS2和IL-1B作为炎症指标来探讨亚硝酸钠对胎盘炎症的影响。低、中、高剂量组TNF、NOS2、IL-1B浓度均高于对照组，且作用呈剂量依赖性。与低、中剂量组相比，高剂量组TNF、NOS2、IL-1B水平显著升高（图1C）。研究了亚硝酸钠诱导的氧化应激对胎儿大脑皮层组织的影响。与对照组相比，亚硝酸钠处理组的ROS和MDA水平呈上升趋势，高剂量组ROS和MDA水平明显升高（图1D和1E）。但亚硝酸钠处理后SOD浓度呈下降趋势，其中高剂量组效果比较显著（图1E）。这些结果表明，过量的亚硝酸钠暴露导致氧化应激、损伤和炎症。高剂量组胎鼠大脑氧化应激损伤很严重;因此，选择高剂量组作为模型组进行后续实验。
ω-3 改善妊娠期亚硝酸钠暴露后的不良妊娠结局
进一步研究了PUFA ω-3对妊娠大鼠亚硝酸钠诱导的损伤的治疗作用。因此，测量并记录每窝胎儿的数量、活胎儿的数量、性别、体重和脑重。PUFA ω-3 处理缓解了亚硝酸钠引起的窝产仔数下降趋势（图2A）。模型组胎儿成活率低于对照组；然而，PUFA ω-3 组的这一比率高于模型组（图2B）。观察到雌性大鼠的比例没有显着差异（图2C）。根据观察到的结果，亚硝酸钠暴露后胎儿的平均体重和脑重显着降低。与模型组相比，PUFA ω-3组胎儿平均体重和脑重显着增加（图2D和2E）。这些发现表明，在怀孕期间接触亚硝酸钠后，ω-3 可改善不良妊娠结局。
ω-3 减轻妊娠期亚硝酸钠暴露引起的胎儿脑损伤
进一步研究了PUFA ω-3对亚硝酸钠引起的脑组织损伤的影响。H&E染色显示对照组细胞排列紧密，细胞数量多，核圆形。模型组细胞组织松散，细胞间隙增加，细胞数量减少，部分细胞变长、拖尾，说明亚硝酸钠对大脑皮层细胞有破坏作用。与模型组相比，PUFA ω-3组细胞排列更紧密，细胞数量更多（图3A）。
此外，为进一步研究PUFA ω-3的作用，通过IHC检测了紧密连接蛋白（OCLN 和 TJP1）。模型组OCLN和TJP1水平显着低于对照组。相比之下，PUFA ω-3组的OCLN和TJP1水平显着高于模型组（图3B和3C）。上述结果表明，PUFA ω-3可减轻胎儿脑损伤，并可降低妊娠期亚硝酸钠暴露引起的血脑屏障（BBB）功能。
ω-3 通过 NRF1/HMOX1 通路减轻亚硝酸钠暴露引起的胎鼠大脑皮质组织损伤
为进一步研究多不饱和脂肪酸（PUFA）ω-3对胎儿炎症的影响，检测了胎盘和大脑皮层组织的炎症因子。亚硝酸钠暴露增加胎盘组织TNF和IL-1B水平。PUFA ω-3组TNF和IL-1B浓度低于模型组（图4A）。PUFA ω-3缓解了大脑皮层组织Tnf、Nos2和Il1b mRNA和蛋白表达水平的升高（图4B和4C）。转录因子SOX2在哺乳动物器官的早期发育中起着重要作用。采用IF法分析胎鼠大脑皮层SOX2、ENO2、TUBB3的表达。与模型组比较，PUFA ω-3组SOX2、ENO2、TUBB3表达显著增加（图4D、4E）。
其次，为进一步探讨PUFA ω-3的治疗机制，测量NRF1/HMOX1蛋白的表达，一个与氧化应激相关的经典途径。与模型组比较，PUFA ω-3上调Nrf1和Hmox1的表达（图4F和4G）。提示PUFA ω-3可通过NRF1/HMOX1通路减轻亚硝基钠暴露引起的胎鼠大脑皮层组织损伤。
ω-3 减轻妊娠期亚硝酸钠暴露引起的胎儿皮质组织线粒体损伤
用流式细胞仪检测线粒体功能。亚硝酸钠暴露增加了胎儿皮质组织的ROS和JC-1水平；添加PUFA ω-3后，这些物质水平降低（图5A和5B）。PUFA ω-3减轻了亚硝酸钠诱导的MDA浓度升高和SOD浓度降低（图5C）。
与对照组相比，模型组复合物II、IV活性降低。
与模型组比较，PUFA ω-3组复合物II、复合物IV及ATP活性显著升高（图5D、5E）。
通过qRT-PCR分析线粒体mt-Co1基因的表达，结果显示亚硝酸钠暴露降低了mt-Co1 mRNA的表达。PUFA ω-3组mt-Co1 mRNA表达明显高于模型组（图5F）。
利用透射电镜（TEM）研究了PUFA ω-3对亚硝酸钠引起的线粒体氧化应激损伤的影响。与对照组相比，模型组线粒体数量减少，线粒体内部结构受损。与对照组相比，模型组线粒体膜模糊，线粒体结构严重受损。
值得注意的是，PUFA ω-3组线粒体损伤减轻（图5G）。结果表明，PUFA ω-3可减轻亚硝酸钠暴露对胎儿皮质组织线粒体的损伤。
图6显示了PUFA ω-3减轻亚硝酸钠诱导的损伤的可能机理。
总的来说，补充PUFA ω-3可减轻胎盘和大脑皮质组织炎症、不良妊娠结局、血脑屏障功能损害、脑神经功能损害、氧化应激损伤和妊娠期间过量亚硝基钠暴露引起的线粒体损伤。这些作用可能与NRF1/HMOX1通路有关。本研究从大鼠模型中提供证据，表明孕期补充多不饱和脂肪酸ω-3对胎儿的健康和发育有促进作用。
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