Nature子刊：热量限制完胜！减缓肿瘤进展转移，增强免疫能力！

癌症发病率随年龄增长而增加，是死亡的主要原因。热量限制（CR）有益于健康和生存，并延缓癌症的发生。然而，由于CR的严格要求，提供同样的癌症保护的饮食替代品变得越来越有吸引力，这些方法包括改变摄食频率、饮食组成和或禁食时间等。

早期的研究表明，短时间的极低热量摄入，包括短期禁食（2-4天）或特定宏量营养素的饮食控制，可以有效地延缓原发肿瘤的生长。相反，过量食用动物蛋白会增加癌症风险和全因死亡率。不同形式的间歇性禁食 （IF） 和时间限制禁食（TRF）的主要特征是低热量摄入或完全禁食的周期，循环穿插在随意喂养（AL）周期之间。IF和TRF可显著减少肿瘤生长，并作为化疗的辅助剂和癌症预防工具，具有很好的转化应用前景。

然而，目前还不清楚禁食时间、饮食限制水平或营养成分是否是预防癌症的主要因素。本研究评估了在4T1乳腺癌小鼠模型中，饮食组成与低热量摄入对延迟肿瘤生长的相对影响。使用小鼠乳腺癌模型，我们比较了每日CR与FMD或等热量标准实验室食物的周期性热量循环对原发肿瘤生长和转移负担的效力。

1、低热量循环减缓肿瘤生长，与饮食组成无关

在16周龄的BALB/cJ雌性小鼠中，研究了饮食组成和4：10喂养周期对三阴性乳腺癌(TNBC)生长速率的影响，小鼠植入了乳腺中的同系和高转移性小鼠4T1癌细胞。比较了4：10循环的FMD与等热量标准实验室饲料(AIN-93g)，也称为“低热量循环喂养”(LCC)的反应。在严重低热量摄入的4天中，FMD和LCC小鼠暴露于50%：70%：70%：70%的日热量减少，随后10天用 AIN-93G 日粮饲喂AL(图1a，补充图1a)。在注射4T1肿瘤细胞一周后，小鼠接受两次4：10周期的FMD或LCC（图。1b)，与AL对照组相比，显示出肿瘤生长速率(图1c)和肿瘤面积(图1d)出现类似的下降。在两个周期中，FMD和LCC小鼠的体重(图1e，补充图1b)和食物消耗轨迹(图1g)相同，28天期间的平均体重(图1f)和热量摄入(图1h)均总体下降。这些结果表明，极低卡路里循环，而不是饮食构成本身，是延迟肿瘤发生的主要驱动因素。

2、治疗性 CR 干预比热量循环更能减缓肿瘤生长

先前的研究已经证明CR在延缓乳腺肿瘤生长方面是有效的。我们试图比较4：10周期的FMD和LCC是否与每日CR一样有效。每日CR的摄入量以FMD/LCC每4：10循环的平均热量摄取量为基础，比AL低约20%。在肿瘤植入后7天，与热量循环组(FMD和LCC)同时引入一个CR组(如图2a所示)，该组每天接受20%的CR，采用的是AIN-93G饮食（4t1后CR）。在实验过程中，所有干预均导致体重显著下降（图2b，补充图2a）， FMD和LCC小鼠的平均热量摄入减少了约20%，与每日CR组的限制摄入量相似（图2c）。

在处死小鼠时（第二次FMD/LCC循环再饲喂第3天，即CR循环第21天)，对各种代谢指标进行评估。CR小鼠的葡萄糖水平呈下降趋势（图2d），而FMD和LCC组的胰岛素水平和HOMA2-IR值升高(图2d、e、f)。CR 和 FMD 小鼠的 IGF-1 水平显著降低，LCC 组也有类似的趋势(图2g)。代谢结果的差异突出了日常CR与短期CR之间的差异。

事实上，CR小鼠在处死前一直处于限制卡路里的状态，而FMD和LCC小鼠在第二次再喂食期的第三天被处死。这个内在提示可以解释观察到的代谢标志物的变化。在进食与禁食状态下收集的样本导致代谢标志物和肝脏基因表达的显著变化。

因此，FMD和LCC小鼠的肝脏质量增加（图2h) ，以及代谢标记在重新喂养期开始出现的峰值，可能是对 FMD 和 LCC 小鼠进行为期4天的极低热量摄入量(70%限制)后，补偿性过度进食的结果。对肝蛋白、甘油三酯和糖原含量的评估显示，在三种饮食模式中，只有总蛋白显著下降(补充图2b-d)。每一种干预都导致了肿瘤生长的显著延迟(图2i， j)和肿瘤体积的减少(图2k)，特别是在每天喂食CR与喂食AL组中。

已知肿瘤进展与促进肿瘤免疫细胞的脾聚集(脾肿大)正相关。在每日CR和FMD或LCC周期小鼠的脾脏质量显著降低(图2l)。我们推测，肿瘤生长的减少可能是由于促进肿瘤生长的免疫调节细胞数量的减少造成的。免疫组化（图2m）显示没有一种饮食干预能够降低肿瘤生存能力。因此，无论饮食成分如何，热量摄入减少和/或禁食时间延长似乎是肿瘤生长下降的关键驱动因素。然而，每日CR比4：10周期FMD和LCC在体内延迟4T1肿瘤发生更有效，即使接受的是相似程度的卡路里限制。

3、CR在延缓肿瘤生长中的预防和治疗效果

为确定在4T1植入前的预防性CR与治疗性CR相比，在延缓4T1肿瘤生长方面是否更有优势，在图2所示的研究中纳入了一个额外的治疗组(实验设计见补充图3a)。结果显示无论在4T1细胞植入前还是后启动，CR在延缓原发性肿瘤生长方面同样有效（补充图3m）并降低原发性肿瘤的整体质量（补充图3o） 和脾脏质量 （补充图3p)。然而，在两组荷瘤小鼠中，经H&E染色的肿瘤切片定量的原发肿瘤活力并未因每日CR而降低(补充图3q)。

4、CR在减轻转移性负担的预防和治疗效果

接下来，我们评估了这些饮食干预措施对4T1细胞转移扩散的影响。将4T1癌细胞矫形植入BALB/cJ的乳腺，容易转移到各个部位，提供了一个有用的体内模型来评估每日CR或FMD和LCC循环方案是否可以延缓肺转移的发展和进展。在28天的4T1肿瘤刺激后，每天进行CR (4T1植入前或后)的小鼠肺转移性结节显著减少(图3a， b)。出人意料的是，FMD 和 LCC 方案没有带来这样的益处，因为与 AL 对照组相比，FMD 和 LCC 小鼠肺中的转移灶没有显著差异(图3a， b)。CR（4T1 植入前或后植入）的小鼠（比起 FMD 或 LCC ）的肺上，有更少肉眼可见的大转移灶（大小为 >1.5 毫米）(图3c)， 这表明更显著的转移性生长。在H&E染色的肺切片中，只有每日CR (4t1植入前后)组的转移灶显著减少(图3d)。总之，CR对TNBC小鼠模型的生长和扩散有预防和治疗作用。

5、预防性CR比热量循环更能减缓肿瘤生长

与AL对照组和预防CR组相比，热量循环组小鼠的平均体重(图4b)和热量摄入(图4c)也出现了类似的下降，CR或热量循环均未观察到瘦体重或脂肪量的显著损失(补充图1c-e)。

在处死时(第四个FMD/LCC周期的第3天和CR第49天的重饲)测量的代谢标记物显示，每天CR小鼠的葡萄糖水平显著下降(图4d)。在治疗组和AL对照组之间没有观察到胰岛素水平和HOMA2-IR指数的差异(图4e， f)，尽管在FMD和每日cr喂养的小鼠中IGF-1水平显著降低(图4g)。FMD方案导致肝脏重量显著增加(图4h)，而FMD和LCC方案增加肾脏重量(补充图4f)。结果表明，在4T1植入前，热量循环小鼠(FMD和LCC)进行了代谢“启动”，为代谢适应严重热量限制和AL再喂养的周期留出足够的时间。

在4T1植入前，所有干预措施均导致肿瘤生长减少，特别是在每天cr喂养的小鼠中(图4i， j)，肿瘤体积(图4k)和脾脏重量(图4l)同时减少。每日CR是唯一能够显著降低肺转移负担的干预措施(图4m， n)。这些发现表明，每天CR在降低肿瘤生长速率和转移负担方面比热量循环方案更好。

6、CR有效减少原发肿瘤切除术后的肿瘤转移

与AL喂养小鼠相比，无论是否切除肿瘤，每日CR和FMD或LCC周期在降低平均体重和热量摄入方面同样有效(补充图5b-d)。肿瘤生长28天后，每日CR和周期FMD或LCC导致肿瘤体积减小，脾脏变小。每天进行CR和热量循环的小鼠在14天后切除的肿瘤体积更小(补充图5e， f)，对于CR和FMD，肿瘤体积显著减少，LCC组呈下降趋势(补充图5g)。第14天切除肿瘤，第28天处死时脾脏变小(补充图5h)。在切除肿瘤小鼠中，尽管在CR组中观察到这一趋势，但没有任何饮食干预措施能进一步减少转移瘤的数量。每日CR是唯一能够限制28天肿瘤负荷小鼠肺转移形成的干预措施(补充图5i， j)。这些发现表明，日常CR比周期FMD或LCC更能抑制小鼠肺转移。

7、CR程度与延迟肿瘤生长

由于大多数乳腺癌病例发生在绝经后女性，我们试图比较不同程度的CR(10-40%)与4：10周期的FMD和LCC在延迟原发肿瘤生长方面的好处(图5a)。与AL对照组相比，CR水平剂量依赖性地降低了11月龄绝育雌性小鼠的平均体重和食物消耗(图5b， c，补充图6a，b)。30%和40%的CR显著降低了血糖水平，但胰岛素水平和HOMA2-IR指数没有变化(补充图6d-f)。与年轻的雌性相比，使用FMD或LCC的绝育小鼠显示出与AL喂养的对照组相似的胰岛素水平和HOMA2-IR指数(补充图6e， f)。只有30%的CR组IGF-1水平显著降低(补充图6g)。老年与年轻雌性小鼠的独特代谢特征表明，年龄和生殖状态而不是肿瘤负担本身可能是代谢稳态的更大决定因素。

CR干预(20-40%)导致原发肿瘤生长率显著下降和肿瘤体积减少(图5d， e)。CR组的脾脏重量也显著降低(图5 g)。与年轻的雌性不同，FMD或LCC对老年雌性小鼠4T1肿瘤发生没有保护作用(图5d， e)。从H&E染色信息显示，饮食干预没有改变肿瘤的生存能力(图5h， l)。因此，似乎20-40%的CR，而不是热量循环(LCC或FMD)，可以延缓生育后女性原发肿瘤的生长。

20-40% CR组的生殖后小鼠的转移数量显著降低(图5j和补充图6h)，而10% CR组和LCC组则呈现下降趋势。H&E染色肺切片组织学定量显示，随着CR水平的升高，总转移面积显著下降(图5k， l)，这与在年轻小鼠中观察到的转移负荷变化一致。尽管生殖后的女性肺转移面积更大(补充图6j)。

8、CR程度升高对肿瘤生长延迟的治疗作用

在饲养干预21天后，在处死时评估代谢参数。40% CR显著降低了循环中的葡萄糖水平(补充图7e)和IGF-1水平(补充图7h)，而与AL对照组相比，所有治疗组对胰岛素水平和HOMA2-IR指数均无影响(补充图7f， g)。治疗性CR干预(20-40%)，与预防性CR治疗一样，导致原发肿瘤生长速率(补充图7i， j)和肿瘤体积(补充图7k)显著的、剂量依赖的下降。与AL相比，20-40% CR组小鼠的脾脏重量也显著降低(补充图7l)。治疗性CR(20-40%)也导致转移瘤数量显著减少(补充图7m)，包括晚期转移瘤(大于1.5 mm)(补充图7n，o)。综上所述，这些发现表明CR(20-40%)在延迟原发肿瘤生长和转移负担方面是有效的，无论它是在4t1接种前还是接种后开始。

9、CR 和热量循环导致独特的免疫特征

人类和骨髓乳腺癌的生长和转移需要调节性免疫细胞。因此，我们试图确定每日CR和4：10周期的FMD和LCC是否导致独特的免疫特征。FoxP3CD4 Treg细胞和原发性肿瘤区或晚期转移之间有饮食依赖的正相关关系。与AL对照组相比，每日CR、FMD和LCC周期的肿瘤小鼠外周血中FoxP3+CD4+细胞的频率显著降低(图6a，补充图8a)。FMD 是唯一能够显著降低脾脏 FoxP3CD4 Tregs 百分比的方案（图6b，补充图8b)。

然而，与CR诱导的肺转移减少相比(图3)，转移进展没有受到LCC和FMD的阻碍，这表明有额外的免疫细胞参与。量化FoxP3CD8 Tregs的频率表明，虽然LCC和CR小鼠外周血中FoxP3+CD8+ Treg水平显著降低(图6c，补充图8c)，但CR小鼠脾脏中FoxP3+CD8+ Treg水平显著降低(图6d，补充图8d)。提示CR介导的4T1肺转移抑制可能是通过抑制这些免疫抑制细胞的激活和上调而发生的。

未检测到外周血中MDSCs的频率有任何变化(图6e，补充图8e);然而，它们在CR动物脾脏中的频率显著降低(图6f和补充图8f)。在LCC和CR小鼠中，FoxP3+CD8+ treg与MDSCs的比值显著降低(补充图9a)。CR也显著增加了脾脏和周围血液中肿瘤细胞毒性效应器T细胞（Eff CD8和CD4）的频率(图6 g-j和补充图8 g-j)。综上所述，外周血和脾脏中的三种主要免疫抑制标记物，它们在持续CR中显著下调。

10、肿瘤免疫微环境的重塑

肿瘤微环境(TME)是促肿瘤免疫重编程的主要中心之一。由于肿瘤倾向于免疫抑制环境，我们试图描述TME内免疫抑制标志物的变化。本研究发现CD4+Foxp3+ treg的数量没有显著差异(图7a，补充图10a)，与先前在CR45浓度为30%的4T1模型中的发现相匹配。然而，在每日CR小鼠中，CD8+Foxp3+Tregs(其水平与不良预后相关)的频率呈下降趋势(图7b，补充图10b)。

我们在FMD和每日CR小鼠肿瘤中检测到MDSCs总量显著减少(图7c，补充图10c)。探索MDSC亚群时仅在CR小鼠中发现PMN-MDSCs的频率显著降低，但M-MDSCs的频率没有降低(图7d， e)。这些发现与在乳腺癌患者肿瘤中发现的结果相吻合。CD4+和CD8+细胞中CD103+的表达只有在每日CR小鼠中才明显升高(图7k， j和补充图10h， i)。

综上，本研究一项关键发现是，每日CR比热量循环更能显著减少原发肿瘤的生长。日常CR和其他不太严格的CR形式可以限制肿瘤进展。

另一个关键观察则是在每日CR的外周组织中识别免疫重塑。每天CR能引起CD8和CD4细胞在外周组织增加。在CR喂养的小鼠的TME中，CD4或CD8细胞的数量没有受到影响，但细胞毒性杀灭潜力被提升。因此，CR可以改造TME，以抑制恶性细胞生长，同时增强T细胞增殖和细胞毒性能力。

热量循环（LCC或FMD）对老年女性肿瘤进展的影响减少是这项研究的另一个重要发现。每日CR水平增加（20%或更高），无论在4T1注射前或注射后，都会导致老年女性的肿瘤负担显著减轻，而热量循环组的肿瘤生长速度仍有增无减。

即使是短期的每日CR，从20%到40%，都能够显著减少转移负担，而热量循环（LCC或FMD）是无效的。此外，在原发性肿瘤切除后，热量循环（LCC或FMD）无法阻止肺转移进展，而CR则呈下降趋势。

总的来说，CR毫无疑问是对诱发和自发癌症最有效的非药物干预。本研究结果表明，与每日CR相比，4：10喂养周期的有效性较低，且不能防止肺转移，无论饮食组成如何或何时治疗起始(4t1注射前或后)。重要的是，每天的CR引发一个独特免疫激活特征，显著减少肿瘤促进免疫细胞(CD11b+Gr1+)的数量，同时上调抗肿瘤(CD8+和CD4+)免疫细胞。这些发现表明，在4T1小鼠乳腺癌模型中，CR的持续时间和程度是决定对癌症进展的保护的最关键因素。

原文来源：

Laura C. D. Pomatto-Watson， et al. Daily caloric restriction limits tumor growth more effectively than caloric cycling regardless of dietary composition.

NATURE COMMUNICATIONS | (2021) 12：6201 | https：//doi.org/10.1038/s41467-021-26431-4 | www.nature.com/naturecommunications