神经干细胞来源的研究进展

[摘要]神经干细胞(neural stem cells,NSCs)是近期神经生物科学领域和神经外科领域的研究。应用神经干细胞自我更新和多分化潜能的生物学特性,移植治疗神经系统损伤或神经系统退行性疾病，已形成一种全新概念的神经外科治疗途径。然而如何获取大量的神经干细胞用于动物实验和临床应用成为限制该技术发展的难题，本文就目前神经干细胞获取方法的研究进行综述。

[关键词]：神经干细胞；移植；诱导分化

神经干细胞是指具有分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞的能力，能自我更新并足以提供大量脑组织细胞的一类细胞的总称[1，2]。应用神经干细胞移植治疗神经系统损伤或神经系统退行性疾病，已成为神经生物科学领域和神经外科领域的研究热点。由于取材、伦理、安全性等方面的原因，如何获取大量的神经干细胞作为种子细胞，成为了各国学者研究的热点之一。本文就各种神经干细胞的获取方法及特点概述如下：

     一、胚胎干细胞

     胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)是指来源于囊胚内细胞团的一类具有自我更新和多潜能分化能力的细胞,在相应条件下具有分化成机体三胚层细胞的潜能。1981年,Evans等[3]从小鼠囊胚中得到第一个哺乳类动物来源的 mESCs,1998年,Thomson 等[4]从冷冻的体外受精多余囊胚中建立了hESCs 系。目前已有大量 ESCs移植的动物实验[5],证实了 ESCs来源的神经元细胞移植入动物后,可以和动物的大脑整合在一起。为临床上的一些严重疾病包括神经系统退行性疾病的细胞替代治疗和组织工程提供理想的种子细胞。但ESCs直接注入动物体内,可形成畸胎瘤,要使ESCs将来应用于临床必须经过体外诱导分化,避免其致瘤性,并尽量得到比较纯的前体细胞或特定类型的成熟细胞。目前ESCs向神经细胞的诱导分化主要有以下几种方法：

1、最常用的方法是Bain等[6]建立的,在维甲酸或生长因子处理下，悬浮培养形成胚状体并由此得到神经前体细胞或神经细胞。经免疫细胞化学证实其表达神经细胞的分子标记如神经丝(neurofilament,NF)和微管蛋白(tubulin),并且在基因转录水平也同样检测得到。这些细胞还能形成有功能的突触并具有神经细胞的电生理特性。但该方法的不足之处是：第一，神经干细胞产物中可能并存其他细胞谱系,用于细胞替代治疗的较理想的细胞应为神经前体细胞或单一类型的较成熟的特定神经细胞。第二, 维甲酸诱导的神经前体细胞会出现发育受限, 理想的种子细胞需要较强分化、生长能力;第三,维甲酸有致畸作用,不能满足细胞移植安全性的要求[7]。

2、与中胚层来源的细胞共培养诱导神经细胞的分化。建立了ESCs与中胚层来源的基质细胞共培养的系统。Nakayama等[8]将鼠ESCs与神经胶质细胞共同培养或使用神经胶质细胞培养基,即能产生大量的神经干细胞。还有一些研究者报道已成功将ESCs诱导分化为多巴胺神经[9]。这种共培养系统的不足之处在于培养体系中由中胚层来源的细胞所分泌的因子并不明确,因而不能很好地帮助研究者解释其神经诱导的具体机制,而且每次由中胚层来源的细胞所分泌的因子都可能有所不同,故很难保证每次诱导分化的结果都保持一致。

3、利用碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)建立谱系选择法。bFGF是早期神经前体细胞生存、增殖的重要因子,利用这一特性,Okabe 等[10]建立了一套利用bFGF选择性扩增神经前体细胞的培养体系。该诱导方法得到的神经细胞基本上处于相同的发展阶段,神经元类型倾向于中脑、后脑部位的神经元。该方法解决了Bain方法神经干细胞产物中可能并存其他细胞谱系的问题。是目前利用胚胎干细胞诱导分化神经干细胞较公认的方法。

尽管 ESCs向神经干细胞诱导、分化的研究取得了令人鼓舞进展，但它仍很难成为临床上移植治疗神经系统疾病的种子细胞。首先是安全性问题，虽然体外诱导实验已经可以得到较单一的神经前体细胞，然而移植入脑内，微环境改变后是否会存在致瘤性成为一个重要问题。其次是伦理、法律问题限制了ESCs的来源。

二、成体神经干细胞

成体神经干细胞(adult neural stem cells,ANSCs)其实是神经干细胞的狭义概念,专指分布于胚胎及成人的中枢及周围神经系统的干细胞，成人中枢神经系统内存在NSCs,如海马齿状回的颗粒下层、侧脑室的室管膜下区等部位。来自管膜下区的新生的神经元可以远距离迁徙到达嗅球形成嘴侧迁移流[11,12]。ANSCs在生长因子、神经递质、激素及损伤、环境因素改变的刺激下,可分化为不同类型的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。ANSCs可以来源于患者本人，经过体外扩增后再移植到患者脑组织，因而可以避免免疫排斥反应的发生，有可能解决了限制干细胞临床应用的伦理和免疫两大难题，因此成为研究热点。

由于从成人神经系统中活体提取ANSCs非常困难，而且手术风险高。此类细胞可在胎儿及新生儿脑中发现[13]。目前ANSCs的动物实验和临床应用均在利用流产胎儿的胎脑提取ANSCs，在胎脑的发育过程中，越早期的胎脑的ANSCs的比率越高。直接分离自然流产的胚新鲜脑组织，可使细胞在体外增殖形成神经球。Torrente等[14]分别利用胎儿间脑、前脑组织 ,在使用表皮生长因子(ep idermal growth factor,EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和白血病抑制因子(leukem ia inhibitory factor,LIF)的条件下扩增出神经球,并诱导ANSCs分化成为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。有研究证实,将ANSCs移植到新生鼠脑内不同区域,结果ANSC依据最终移行和植入的不同位置分化为不同表型的神经细胞[15,16]。Jeong等[17]将人的ANSCs通过鼠尾静脉移植入颅内出血的动物模型中,ANSCs可在大脑中存活、并迁移至血肿周围区域, 大多数移植细胞分化为神经胶质细胞(大约75%),一部分分化为神经元细胞(大约10%),2周后大鼠功能改善。田增民报道[18，19]将胎儿的ANSCs移植入帕金森症、小脑萎缩的患者脑内，患者的神经功能障碍明显好转。研究发现[20]移植到脑内的ANSCs更易分化为胶质细胞, 这与神经系统疾病伴发炎症反应及胶质反应而触发的再生信号有关。ANSCs促进功能恢复的机制之一可能与替换或修复神经回路有关。有报道, 当鼠ANSCs移植入脑缺血大鼠模型,可发现移植细胞表达连接蛋白[21]。另一种机制与ANSCs分泌营养因子有关。

理论上ANSCs的替代治疗还可通过内源性ANSCs的原位激活,但也由于其诱导分化的调控机制并未阐明,且动物模型产生的多为胶质细胞,因而无法实现。而利用流产胎儿脑中的ANSCs进行体外扩增,并移植达到治疗作用,目前已有临床报道[18，19].但由于流产胎儿的伦理问题直接,限制了此类种子细胞的供体来源，同时此类细胞仍存在免疫排斥反应的担忧。尽管如此由于ANSCs在体外及体内的分化均得到了证实，安全性较ESCs明显提高，目前仍是临床应用较多的种子细胞。

三、间充质干细胞

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有分化成间质起源的任意组织的潜能,包括向神经元样细胞、软骨、脂肪、造血基质及骨等分化成熟的特征[23,23]。MSCs不仅存在于骨髓中,也可从脐血、外周血中以及脂肪组织、肌肉、胎儿器官、大脑、牙齿中分离。也有人从脐带静脉内皮下层分离出 MSCs[24]。由于 MSCs取材范围更加广泛，同时可以取自自体组织可以解决伦理、免疫问题, 故而成为目前研究的热点, 使其作为最佳种子细胞在组织工程中令人看好。人们把间充质干细胞可以跨系, 甚至跨胚层分化这一特性称为干细胞的可塑性, 也称为横向分化[13]。利用这一特性在体外大量诱导分化成神经细胞后,可作为治疗神经系统损伤疾病的种子细胞来源。Satake等[25]建立了大鼠脊髓损伤模型, 通过转导包含绿色荧光蛋白的AVONA病毒基因而标记的MSCs移植入蛛网膜下腔, 结果证实 MSC 能分化为成熟神经元及神经胶质细胞。Jeong[26]的一项体外实验从脐血中分离的MSCs加入特定培养基后,可快速分化为神经元及神经胶质细胞。

体内许多实验结果证实,骨髓、脐血、外周血以及脂肪组织中MSCs移植后可改善神经功能恢复, 然而只有很少的移植细胞可在大脑内发现，而且只有其中的一小部分移植细胞表达神经标志。学者认为[27] MSCs的治疗机制不太可能替代损伤的神经组织，可能是分泌出营养因子, 从而增强了大脑修复的内源性机制。目前MSCs的研究仍停留在动物实验阶段，主要原因一方面是MSCs向神经干细胞定向诱导分化需要条件高，往往分化为神经干细胞的比例很低，同时脑内表达为神经细胞的数量较少，治疗效果有限；另一方面是MSCs同时可以向多种类型细胞分化，移入脑内后的安全性问题限制了其临床应用。但作为能够诱导分化为神经干细胞，同时可以解决伦理、取材难题的种子细胞，MSCs仍将是干细胞领域研究的热点。

四、前景与展望

神经干细胞移植应用于治疗神经系统疾病具有很大的潜能，为神经外科医师提供了全新的治疗模式。然而如何获取大量可以用于移植的神经干细胞，如何保障神经干细胞移植后安全性，如何解决异体移植免疫排斥，如何解决神经干细胞的伦理和法律等问题, 都需要神经生物学家、神经外科医师等多方协作，努力将细胞移植治疗 以一种安全有效的方式引入到临床治疗方案中。

参考文献：

1 Mckay H.Stem cell in the central nenetvons system[J]. Science,1997,276(5309):66.

2 Gage F H.Manunalian neural stem cell[J].2000,287(5457);1433.

3 Evans MJ, Kaufman MH.Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos[J].Nature,1981,292(5819):154-156.

4 Thomson JA,Itskovitz-Eldor J,Shapiro SS,et al.Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts[J].Science,1998,282(5391):1145- 1147.

5 Carpenter MK,Cui X, Hu ZY,et al.Isolation and cloning of neural stem cells from the embryonic human CNS[J].Exp Neurol,1999,158(2): 265-271.

6 Bain G, Kitchens D, Yao M,et al.Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro[J].Dev Biol,1995,168(2):342-357.

7 Zhang JQ, Yu XB, Ma BF,et al.Neural differentiation of embryonic stem cells induced by conditioned medium from neural stem cell [J].Neuroreport,2006,17(10):981- 986.

8 Nakayama T,Momoki-Soga T,Yamaguchi K,et al.Efficient production of neural stem cells and neurons from embryonic stem cells[J].Neuroreport,2004,15(3):487-491.

9 Lau T,Adam S,Schloss P.Rapid and efficient differentiation of dopaminergic neurons from mouse embryonic stem cells[J].Neuroreport,2006,17(10):975-979.

10 Okabe S,Forsberg-Nilsson K,Spiro AC,et al.Development of neuronal precursor cells and functional postmitotic neurons from embryonic stem cells in vitro[J].Mech Dev,1996,59(4):89-102.

11 Lois C,Alvarez-Buylla A.Long-distance neuronal migration in the adult mammalian brain[J].Science,1994,264(5162):1145-1148.

12 Alvarez-Buylla A,Garcia-Verdugo J M,Tramontin AD.A unified hypothesis on t he lineage of neural stem cells[J].Nat Rev Neurosci,2001,2(4):287-293.

13 Terskikh AV,Bryant PJ,Schwartz PH. Mammalian stem cells [J].Pediatr Res,2006,59(42):13-20.

14 Torrente Y,BelicchiM,Pisati F,et al.A lternative sources of neurons and glia from somatic stem cells[J].Cell Transp lant,2002,11(1):25-34.

15 Englund U,Fricker-Gates RA,Lundberg C,et al.Transplantation of human neural progenitor cells into the neonatal rat brain:extensive migration and differentiation with long-distance axonprojections.Exp Neurol,2002,173(1):1-21.

16 Rosser AE,Tyers P,Dunnett SB,et al.The morphological development of neurons derived from EGF and FGF-2 driven Human CNS precursors depends on their site of integration in the neonatal rat brain [J].Eur J Neurosci,2000,12(7):2405-2413.

17 Jeong SW,Chu K,Jung KH,et al.Human neural stem cell transplantation promotes functional recovery in rats with experimental intracerebral hemorrhage[J].Stroke,2003,34(9):2258- 2263.

18 田增民,刘爽,李士月,等.人神经干细胞临床移植治疗帕金森病[J].第二军医大学学报,2003,24(9):957-959.

19 田增民,李志超,尹丰,等.人神经干细胞移植治疗小脑萎缩[J].第二军医大学学报,2004,25(9):933-935.

20 Snyder EY,Daley GQ,Goodell M.Taking stock and planning for the next decade: realistic prospects for stem cell therapies for the nervous system[J].J Neurosci Res,2004,76(2):157- 168.

21 Bliss T, Guzman R, Daadi M,et al.Cell transplantation therapy for stroke[J].Stroke,2007,38(2):817- 826.

22 Boyle AJ,Schulman SP,Hare JM,et al.Is stem cell therapy ready for patients‘ Stem Cell Therapy for Cardiac Repair:Ready for the Next Step[J].Circulation,2006,114(4):339-352.

23 Vddndnen HK.Mesenchymal stem cells[J].Ann Med,2005,37(7):469-479.

24 Romanov YA,Svintsitskaya VA,Smirnov VN.Searching for alternative sources of postnatal human mesenchymal stem cells:candidate MSC-like cells from umbilical cord[J].Stem Cells,2003,21(1):105-110.

25 Satake K,Lou J,Lenke LG.Migration of mesenchymal stem cells through cerebrospinal fluid into injured spinal cord tissue[J].Spine, 2004,29(18):1971-1979.

26 Jeong JA,Gang EJ,Hong SH,et al.Rapid neural differentiation of human cord blood-derived mesenchymal stem cells[J].Neuroreport, 2004,15(11):1731-1734.

27 Bliss T,Guzman R,Daadi M,et al.Cell transplantation therapy for stroke[J].Stroke,2007,38(2 Suppl):817- 826.