重组甘精胰岛素对糖尿病大鼠模型代谢影响的实验研究

　　糖尿病(DM)作为一种慢性病已广为之人，伴随着人们寿命的延长和生活水平进一步的提高，糖尿病将成为21世纪对人类健康造成主要危害的疾病之一[1、2]。

　　胰岛素在目前糖尿病的治疗中仍处于不可取代的地位，但传统的猪、牛胰岛素是一种蛋白质，对人而言是一种异种抗原，容易导致过敏反应。重组甘精胰岛素是一种新的长效胰岛素制剂，为了评价该药的疗效特进行该实验。

　　1 材料和方法 1.1 动物和饲料健康合格清洁级Wistar大鼠，雌雄兼用，体重180~250g，由重庆医科大学实验动物中心提供，许可证号SCXK(渝)20020001，环境设施合格证医动字第310103002号。

　　标准饲料:蛋白质占23%，碳水化合物占53%，脂肪占5%;高脂饲料：在5000g标准饲料中加入1500g猪油，750g白糖，100g奶粉，300g鸡蛋，蛋白质占20%，碳水化合物占50%，脂肪占20%。

　　1.2 受试药物及其配制受试药物：重组甘精胰岛素注射液(重庆富进生物医药有限公司，批号：20031101)，标示量3.637mg/mL，含重组甘精胰岛素100IU，溶媒为0.3%间甲苯酚，2%甘油，pH值为4.0，冰箱4度保存。

　　对照药：德国Lantus(Acentis Pharmaceuticals.Inc生产，批号L382)，标示量3.637mg/mL，含重组甘精胰岛素100IU，溶媒为0.3%间甲苯酚，2%甘油，pH值为4.0，冰箱内4度保存。

　　链脲佐菌素(STZ)：sigma公司出品。血糖试剂盒、甘油三酯(TG)试剂盒总胆固醇(TC)试剂盒、总蛋白(TP)试剂盒、血清白蛋白(ALB)试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismIUtase,SOD)试剂盒、脂质过氧化产物(malondiadehyde,MDA)试剂盒、黄嘌呤氧化酶(XOD)试剂盒及血糖试剂盒，均由南京建成生物工程研究所提供(批号20010319)。

　　1.3 仪器紫外分光光度计(日本SHIMADZU,Uvmini-1240型);离心机(广州会城无线电厂，KDC型);高速台式离心机(上海医疗器械六厂，TGL-16型);电子分析天平(德国Sartorius,BP61型);日立高速冷冻离心机HIMAC(日本，CR-GII);微型漩涡混合器(上海跃进医疗器械厂，VXH-3型);低温医用冰箱(日本SANYO)。

　　1.4 试验分组、剂量确定和给药方案 1.4.1 分组 选8只正常大鼠为正常对照组。按性别、体重、血糖值均衡的原则，将糖尿病模型大鼠40只随机分为5组，每组8只，雌雄各半，分为模型对照组，重组胰岛素注射液大、中、小剂量组和阳性对照组。

　　1.4.2 剂量确定 依照《化学药品和治疗用生物制剂品研究指导原则》的有关要求[3]，低剂量属基本安全剂量，应高于临床或整体动物最佳有效剂量。

　　依据动物急性毒性试验结果，给予糖尿病大鼠胰岛素治疗按小数LD50=38.42mg/mL的1/101/201/40给药，则重组甘精胰岛素注射液大剂量组(Glargine L,GL)1.9mg/kg，中剂量组(Glargine M，GM)0.8mg/kg,小剂量组(Glargine S，GS)0.4mg/kg;阳性对照组德国Lantus0.8mg/kg;模型对照组(Control,C)等容生理盐水，正常对照组(normal control,NC)等容生理盐水。

　　1.43 给药方法 模型成功后皮下注射胰岛素，注射部位为大鼠后肢外侧。

　　1.5 糖尿病模型的建立采用高脂诱导腹腔内注射链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病大鼠模型[4]。将受试Wistar大鼠，适应性饲养1周，随机抽出8只为正常组，喂以标准饲料，余下大鼠喂以高脂饲料，4周后，按30mg/kg体重的剂量一次性腹腔注射STZ(溶于0.1mmol/L柠檬酸缓冲液，pH4.4),72h后测定尾静脉血糖，血糖水平>16.8mmol/L，持续3d，确认为糖尿病动物模型建立成功。

　　1.6 检测的指标及方法 1.6.1 一般观察 观察实验动物的一般临床表现，主要观察精神、体重、进食情况等。测量初始给药时每组大鼠的体重，治疗结束时测每组大鼠的体重。

　　1.6.2 血糖、糖化血红蛋白测定 糖尿病大鼠治疗4周后，进食6h，自由饮水。断头取血，其中一部分分离血清，采用葡萄糖氧化法试剂盒测定血糖值。沉淀红细胞测定糖化血红蛋白值。

　　1.6.3 血清中TG、TC、TP、Alb含量的测定 糖尿病大鼠，治疗4周，按上述方法断食，取血，迅速以3000r/min离心3min,分离血清，按试剂盒方法测定。

　　1.7 统计与分析各组剂量资料的结果用x+s表示，根据《新药(西药)临床前研究指导原则汇编》[5]的有关新药药效学研究中统计处理的指导原则，选择t检验进行各组均数差异显著性检验。

　　2 结果 2.1 一般临床表现模型组大鼠血糖维持在较高水平，并且明显多饮、多食、多尿、毛发灰暗、生长缓慢。每笼均饲养5只，大鼠模型组饮水量为360mL/(只*d)，重组甘精胰岛素注射液大中小剂量组、阳性对照组多饮、多食、多尿症状明显轻于模型组，饮水量约200mL/(只*d)。

　　胰岛素治疗4周内，正常对照组大鼠平均体明显升高;模型组大鼠平均体重明显降低，表现出糖尿病多饮、多食、多尿体征，重组甘精胰岛素注射液治疗组及阳性对照组大鼠平均体重也有上升趋势，说明通过胰岛素治疗控制了糖尿病的发展进程。

　　2.2 各组血糖比较采用高脂诱导腹腔内注射链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病大鼠模型后，试验大鼠血糖浓度有非常显著的升高，与正常对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)，重组甘精胰岛素注射液连续用药4周，大、中、小剂量及阳性对照组大鼠血糖浓度较模型组血糖浓度均由降低(P<0.05)。大剂量、中剂量及阳性对照组血糖浓度较治疗前有所降低，小剂量降低不明显。

　　2.3 连续用药4周后各组TG、TC、TP、Alb含量的比较重组甘精胰岛素注射液大、中、小剂量组及阳性对照组与模型组相比对糖尿病大鼠血清甘油三酯的含量有降低作用(P<0.05)，对总胆固醇的升高有降低作用(P<0.05)，对糖尿病血清总蛋白水平、血清白蛋白水平的降低有控制作用(P<0.05)。

　　2.4 连续用药4周对各组SOD、MDA、XOD的影响重组甘精胰岛素注射液对糖尿病大鼠血清SOD活性的降低有显著升高作用(P<0.05)。

　　重组甘精胰岛素注射液对XOD活性的升高有降低作用(P<0.05)，重组甘精胰岛素大剂量和阳性对照组对MDA含量的增加有明显降低作用(P<0.05)

　　2.5 重组甘精胰岛素折射也对糖尿病大鼠血尿素氮含量(BUN)、糖化血红蛋白(Ghb)的影响重组甘精胰岛素注射液大、中、小剂量组，及阳性对照组与模型组相比对糖尿病雕塑血尿素氮的含量有降低作用(P<0.05)。重组甘精胰岛素注射液大、中剂量组及阳性对照组与模型组相比对糖尿病大鼠糖化血红蛋白的含量有降低作用(P<0.05)，小剂量组作用不明显。

　　3 讨论本实验利用链脲佐菌素(streptozotocin ,STZ)建立大鼠糖尿病模型，STZ是一种含亚硝基化合物，能特异性破坏胰岛β细胞，机制之一是通过诱导NO的合成增加对胰岛β细胞的氧化侵袭，与糖尿病人发病时体内氧化侵袭增加相类似。

　　STZ注射破坏胰岛细胞，死亡胰岛细胞作为抗原被巨噬细胞吞噬，产生TH1刺激因子(IL-12)，使TH1细胞系占优势而产生IL-2及IL-1、TNF-α、IFN-γ及氧自由基NO、H2O2、O2，杀伤少量细胞，死亡细胞再次以自身抗原释放，并再次递呈给APC细胞进行处理，释放细胞因子，放大细胞损伤效应，最终导致糖尿病[6-7]。

　　用STZ诱导建立糖尿病大鼠模型后大鼠的血糖升高，体重明显下降，这与机体脂肪代谢紊乱、蛋白质分解代谢加快等因素有关。

　　糖尿病大鼠血清中TG、TC含量升高，TP、Alb含量降低，说明糖尿病大鼠除糖代谢外，脂肪和蛋白质代谢也严重失调。Alb是肝脏合成量最大的蛋白，血清Alb含量的下降，提示肝脏合成能力的下降及肝功能的损伤，同时血清中主要自由基清除酶SOD活性明显降低，与自由基生成密切相关的XOD活性明显升高，血清MDA生成量也增多。