人肺鳞癌及肺炎性假瘤组织的蛋白质差异表达谱的初步建立

　　肺癌是目前全球发病率最高的恶性肿瘤之一。按其组织学分类一般可分为以下4种：鳞癌、腺癌、大细胞癌和小细胞癌。其中以鳞癌最为常见，约占全部肺癌例数的30%～50%。在我国尤其是在大、中城市，肺鳞癌的发病率近数十年来成倍增长，临床统计已占肺癌总数的50%～70%[1]。目前在肺癌发病的分子机制方面，已从基因和转录水平进行了许多成功的研究。然而基因的功能活性主要靠蛋白质来实现，若能直接从蛋白质整体水平入手来研究肺癌，将能更加全面、真实地揭示肺癌的癌变过程。随着对蛋白质组分析技术的出现及在肺癌研究中的应用，已识别鉴定出一些肿瘤标志物并用于临床诊断，但是肺鳞癌蛋白质组研究突显不足，因此有必要对在我国发病率高的肺鳞癌开展蛋白质组研究。

　　本实验室先前的研究已应用固相pH梯度双向凝胶电泳技术分离了人肺鳞癌组织及相应的癌旁正常支气管上皮组织的总蛋白质，并对其差异蛋白质点进行了鉴定，得到了一些有意义的结果。由于炎性假瘤在临床上与肺癌极易混淆，因而本研究拟建立人肺鳞癌组织及肺炎性假瘤的双向凝胶电泳图谱，再利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDITOFMS)及数据库搜索对部分差异表达的蛋白质点进行鉴定，以期为人肺鳞癌与炎性假瘤的早期鉴别诊断、治疗以及新药开发等提供线索。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 组织标本 7例人肺鳞癌组织及7例炎性假瘤取自中南大学湘雅一医院、湘雅二医院的手术切除标本，并经病理诊断确诊。

　　1.1.2 试剂 二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒为Pierce公司产品;硫脲、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺、双向凝胶电泳标准蛋白质、甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲—酮—胰蛋白酶(TPCKTrypsin)、铁氰化钾[K3Fe(CN)6]、三氟乙酸(TFA)、基质α-氰基-4-羟基肉桂酸(CCA)、氯化钙(CaCl2)均为Sigma公司产品;固相pH梯度干胶条(IPG strip pH 3～10L，24cm)、IPG缓冲液(pH 3～10L)、两性电解质(pharmalyte，pH 3～10)、覆盖液、低分子量标准蛋白质、蛋白银染试剂盒、尿素、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺均为Amershan Pharmacia公司产品;甘氨酸、Tris、CHAPS、SDS、DNA酶、RNA酶均为Promega公司产品;硫代硫酸钠(Na2S2O3)、碳酸氢铵(NH4HCO3)为国产分析纯;乙腈为国产色谱纯。

　　1.1.3 仪器 IPGphor等电聚焦仪、Ettan DALT twelve system、ImageMaste 2D Elite 4.01凝胶图像分析软件、Imagescanner扫描仪、Labscan扫描控制和分析前处理软件(Pharmacia公司产品);SaVant冷冻浓缩机(美国);Applied Biosystem VoyagerDETM STR BiospectrometryTM workstation System 4307 MALDITOFMS质谱仪(ABI公司);Elx800自动酶标仪(BioTek Instrumets，Inc)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 组织标本的处理 取术后新鲜的肺癌组织及肺炎性假瘤组织，无菌状态下将组织分别用生理盐水反复清洗，以去除血液，并尽可能剪去多余的其他组织。处理后的样品立即用于蛋白质的抽提或置于-80℃保存。

　　1.2.2 组织总蛋白质的制备 30～80mg组织样品于液氮下充分研磨至粉末状，置于400ml裂解液(7mol/L urea，2mol/L thiourea，2% NP-40，1% Triton X-100，100mmol/L DTT，5mmol/L PMSF，4% CHAPS，0.5mmol/L EDTA，40mmol/L Tris，2% pharmalyte，1mg/ml DNaseⅠ，0.25mg/ml RNase A)中，充分旋涡混匀，置于37℃孵育箱孵育1h，取出后再充分旋涡，4℃，15000r/min离心30min[2]，吸取上清液即为组织的总蛋白质，用BCA蛋白质定量试剂盒测定蛋白质的浓度。

　　1.2.3 固相pH梯度双向凝胶电泳 (1)第一向固相pH梯度等电聚焦:IPGDALT主要按以往的方法进行[2]。将已定量总体积为450ml的组织总蛋白质抽提物与水化液加入24cm IPG持胶槽，放置好IPG干胶条，pH 3～10L(240mm×3mm×0.5mm)后，于IPG phor等电聚焦仪上水化和聚焦在20℃自动进行，总电压时间积为69920Vh，其中于30V低电压水化14h，然后经过500V 1h、1000V 1h，最后稳定在8000V下进行等电聚焦。(2)平衡:等电聚焦结束后，迅速取出一向的IPG胶条先后置于10ml平衡液A(50mmol/L TrisHCL pH 6.8，6mol/L urea，30%甘油，1% SDS，0.2% DTT)和10ml平衡液B(50mmol/L TrisHCL pH 6.8，6mol/L urea，30%甘油，1%SDS，3%碘乙酰胺，痕量溴酚蓝)中分别平衡15min。(3)第二向垂直板SDSPAGE电泳:将平衡后的胶条移至1mm厚的12.5%均匀分离胶的上端，用0.5%琼脂糖封胶，15℃循环水冷却，先设置恒功率2.5W/块胶进行电泳30min，再改用恒功率17W/块胶进行电泳，当溴酚蓝离胶最底端约5mm处停止电泳。

　　1.2.4 银染 均按蛋白质银染试剂盒的操作手册进行。

　　1.2.5 凝胶图像分析 凝胶通过Imagescanner扫描仪以及LabScan扫描软件进行扫描获取图像，利用ImageMaster 2D Elite 4.01分析软件对图像进行强度校正、点检测、背景消减、匹配、1D校正、建立平均凝胶等分析。斑点位置的重复性按Gorbett[3]的方法进行计算。所有数据的统计分析在SPSS for Windows 10.0软件和Excel上进行。

　　1.2.6 制备质谱样品 切取差异蛋白质点，对银染蛋白质用100mmol/L Na2S2O3和30mmol/L K3Fe(CN)6(1∶1)进行脱色，然后用100mmol/L NH4HCO3，10mmol/L DTT于57℃还原1h，再在暗处用100mmol/L NH4HCO3，55mmol/L碘乙酰胺烷基化30min，冻干后加入TPCKTrypsin(0.1g/L)37℃酶解24h，12000r/min离心5min，取上清用Millipore公司ZIPTIPTMC18微柱进行脱盐后与CCA基质液混合，轻微旋涡后均匀点样2ml于不锈钢点样板上，空气中自然风干待分析[2]。

　　1.2.7 质谱分析 将制备好的点样板置于Applied Biosystems Voyager System 4307 MALDITOFMS仪上进行分析，采用反射模式，正离子谱测定，离子源加速电压为20000V，反射电压比为1∶12，N2激光波长337nm，脉冲宽度为3ns，离子延迟提取100 nsec，真空度4×10-7Torr，质谱信号单次扫描累加50次，质谱使用胰蛋白酶自动降解离子峰作为内部标准校正，获得了肽质量指纹图。

　　1.2.8 数据库查询 通过因特网在ExPASY的中国镜像站点CBI的PeptIdent软件中进行搜寻。搜寻参数如下：肽质量指纹图中的肽片段质量选择在800～4000Da范围，表观等电点的误差范围为±0.5pH，表观分子量的误差范围为±20%，半胱氨酸为脲甲基半胱氨酸(carbamidomethylCys)，每个肽允许有1个不完全裂解位点，最少匹配肽片段数为4，物种来源选择人类，离子选择[M+H]+和Average，另根据需要调整参数。

　　2 结果

　　2.1 人肺鳞癌组织及肺炎性假瘤的双向凝胶电泳图谱 对来自同一标本的总蛋白质进行3次重复性的检测，发现3次双向电泳图谱非常相似，采用Imagescanner扫描仪扫描获取图像，然后通过ImageMaster 2D Elite 4.01分析软件对其进行点分析，获得肺鳞癌组织及肺炎性假瘤组织3块凝胶的平均蛋白质点数分别为1569±78和1487±64。经过背景消减后，将其中的一块胶定为参考胶，进行3块胶间的蛋白质点的匹配，肺鳞癌组织及肺炎性假瘤组织平均匹配的点数分别为1454±37和1370±43，匹配率分别达92.7%和92.1%。再任意选取同一癌组织的3块胶中相互匹配且分辨清晰的50个蛋白质点，选择位置偏中间的一个点为原点，以参考胶为参考位置，测量出其他两块胶对应点在第一向等电聚焦及第二向SDSPAGE方向上位置的偏差，发现3块胶的蛋白质点在位置上有较好的重复性，不同胶间蛋白质点在IEF方向的偏差是(0.733±0.101)mm，在SDSPAGE方向上的偏差为(0.925±0.207)mm，因此获得了重复性较好的人肺鳞癌组织及肺炎性假瘤组织的双向凝胶电泳图谱。将两者匹配分析，平均匹配点数为1142±51。

　　对7例肺鳞癌组织及7例肺炎性假瘤组织分别同时进行双向凝胶电泳，发现7例癌组织的银染图谱较相似，利用ImageMaster 2D Elite 4.01分析软件对其进行分析匹配，从而建立了7块胶的平均凝胶图，点检测共有蛋白质点1896个。用相同的方法对7例肺炎性假瘤组织双向凝胶电泳图谱进行软件分析，亦建立起其平均凝胶图，点检测共有蛋白质点1834个。建立的平均凝胶用于下一步差异表达分析。

　　2.2 差异蛋白质点的MALDITOFMS肽质指纹分析 通过软件分析肺鳞癌和肺炎性假瘤组织差异表达的蛋白质，选取了至少在4对组织均有相同变化的差异点共23个(其中14个点在癌组织中高表达，9个点在炎性假瘤中高表达)，通过胶内原位酶解，进行MALDITOFMS肽质量指纹图的测定，并以酶自动降解峰(m/z=1993.9772 Da)进行校正，图2为蛋白质点T5的肽质量指纹图谱，搜索数据库后发现其为鸟嘌呤结合蛋白β-亚单位样蛋白。利用Expasy中的PeptIdent查询软件搜索SWISSPROT以及Trembl数据库，并结合双向凝胶电泳相应蛋白质点的表观等电点、分子量、匹配片段的多少以及氨基酸序列的覆盖率进行蛋白质鉴定，共鉴定出23个差异蛋白质，包括有核内转录因子、G蛋白、生长因子、胞浆内激酶等，它们均与细胞信号传导、细胞周期等有关，对促进细胞分裂增殖均起着重要的作用。

　　3 讨论

　　目前蛋白质组学研究主要包括两个方面：一个方面是建立机体组织或细胞的蛋白质组2DPAGE参考图谱和数据库;另一个方面是通过比较生理和病理条件下(如疾病状态或疾病不同发展阶段)蛋白质组分在表达水平、翻译后的修饰加工以及亚细胞定位等方面的改变情况，从而发现和鉴定出有特定功能的蛋白质(群)，深入了解这些蛋白质的结构和功能，将极大地促进疾病(包括肿瘤)的发病机制、诊断、治疗和新药开发等方面的研究。

　　本实验室先前的研究已对人肺鳞癌组织及配对的正常癌旁支气管上皮组织的蛋白质表达谱进行了分析，鉴定了68个与肺鳞癌相关的蛋白质。由于癌旁正常支气管上皮组织在标本采集过程中难以得到十分纯净的上皮，故在蛋白质提取过程中采用了TCA沉淀法以去除黏多糖等成分。因此为了对比性好，同样对癌组织亦进行了蛋白质的沉淀，考虑到这样会丢失掉较多的蛋白质(其中很有可能有一些与癌变密切相关的蛋白)而不利于分子标志物的筛选;而且肺癌及肺炎性假瘤在临床手术前常难以区分而造成误诊。故本研究应用肺炎性假瘤作为对照，建立了人肺鳞癌组织及肺炎性假瘤的双向凝胶电泳的差异图谱，并对差异表达的蛋白质点进行了鉴定，以期为人肺鳞癌发病机制研究及其诊断、鉴别诊断、治疗以及新药开发等提供线索。

　　众所周知，肿瘤的发生发展与细胞增殖、分化、凋亡等正常生命活动息息相关，由于各种基因或蛋白质水平的变化，如一些与细胞生长、分裂和增殖有关的蛋白质过表达而导致增殖失控、凋亡受阻以及侵袭与转移等，使细胞在整个调控网络上表现出与正常细胞的许多区别，最终引起肿瘤的发生。由此可见，许多蛋白的改变与肿瘤发生、发展这一过程密切相关。在本研究中，我们鉴定的23个差异蛋白质中包括核内转录因子、G蛋白、生长因子、胞浆内激酶等，它们均与细胞信号传导、细胞周期等有关，对促进细胞分裂增殖均起着重要的作用。其中有一些蛋白质与我们以往鉴定出的在人肺鳞癌组织及配对的正常癌旁支气管上皮组织中差异表达的肺鳞癌相关蛋白质相同，如原癌基因cJun、上游结合因子(upstream binding factor，UBF)、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白质β亚单位样蛋白、Rho相关的GTP结合蛋白RhoQ、mdm2、XEDAR(Xlinked ectodysplasinA2 receptor)等[2，4～8]。这进一步提示这些差异蛋白质在肺鳞癌发病中具有重要的作用，有可能成为肺鳞癌潜在的分子标志物。

　　总之，我们通过比较蛋白质组学分析，发现了一些肺鳞癌差异表达的蛋白质，但要确认这些蛋白质是否为肺鳞癌相关的蛋白质，还需深入研究这些差异蛋白质的结构、功能及其在人肺鳞癌发生发展中所起的作用。

（责任编辑：钟少玲）