Oncogene：只会助眠褪黑素？它能增强奈拉替尼对乳腺癌的治疗效果！

20%的乳腺癌中存在人表皮生长因子HER2/ERBB2的扩增/过表达。迄今为止，HER2阳性(HER2+)仍是抗HER2靶向疗法中唯一具有临床应用价值的生物标志物，科研人员已开发几种HER2靶向药物，包括单克隆抗体(曲妥珠单抗和帕妥珠单抗)、小分子酪氨酸激酶抑制剂(拉帕替尼和奈拉替尼)和抗体药物偶联物(T-DM1)。虽然HER2靶向药物极大地改善了HER2+乳腺癌的预后，但复发仍不可避免。通过结合不同种类的HER2靶向药物进行组合HER2阻断，已被证明比抗HER2单药治疗更好的抗肿瘤活性。然而，如何提高现有治疗方法的疗效，确定更有效的组合策略，对治疗HER2+乳腺癌迫在眉睫。

奈拉替尼是新一代不可逆的、受体酪氨酸激酶(HER1/EGFR， HER2和HER4)小分子抑制剂，最近已被批准用于治疗HER2+乳腺癌。然而已有研究表明HER家族激酶的过度激活可能导致奈拉替尼耐药。因此迫切需要找到新的靶向治疗组合，通过消除HER2+或HER2突变乳腺癌中HER2的异常表达或激活来提高奈拉替尼的疗效。褪黑激素是人类和哺乳动物松果体分泌的一种天然激素。已有大量研究报道褪黑素通过不同作用机制表现出抗肿瘤特性。

本研究旨在阐明褪黑素单药及与奈拉替尼联合治疗HER2+乳腺癌细胞株的潜在效果。惊喜的是，本研究还揭示了褪黑激素在调节HER2蛋白质稳定性和增强内拉替尼在HER2乳腺癌中的细胞毒性作用的意外作用。

1、褪黑素治疗重现HER2靶向药物的作用

首先检测褪黑激素对三个HER2+乳腺癌细胞系存活率的影响。褪黑素治疗导致细胞死亡以时间和剂量依赖的方式显著增加(图1A)。为了解褪黑激素对HER2+乳腺癌细胞的细胞毒性作用，通过RNA测序对使用或不使用褪黑激素的HCC1954细胞进行转录组分析。基因集浓缩分析 （GSEA） 显示，褪黑激素治疗与包括EMT、KRAS、SRC、NF-κB和il6 - jax - stat3在内的基因集富集显著负相关(图1B， C)，所有这些基因集与her2靶向治疗的疗效相关。 与这些结果一致的是，在HCC1954细胞中，褪黑激素处理导致磷酸化akt、磷酸化erk、磷酸化src信号和磷酸化nf -κB信号显著降低，EMT信号减弱(N-cadherin表达减少，E-cadherin表达增加)(图1D)。褪黑素治疗重现了HER2靶向药物引起的许多效应，促使我们调查褪黑激素是否会影响HER2本身的表达和/或活性。

2、褪黑激素降低HER2蛋白质的稳定性

用褪黑激素治疗的所有三个细胞系中，HER2蛋白质丰度都显著减少（图2A)。而褪黑激素治疗没有降低HER2 mRNA水平，这表明不能在转录水平解释褪黑激素引起的HER2蛋白水平降低。

通过蛋白质合成抑制剂环氧酰胺（CHX）检测褪黑激素对HER2+乳腺癌细胞中现有的HER2蛋白池的影响，HER2蛋白水平在CHX治疗后逐渐降低，而在褪黑激素治疗细胞中观察到HER2的更显著退化（图2B、D）。这表明褪黑激素治疗共同降低了HER2蛋白质的稳定性。

3、褪黑素治疗通过促进HER2的内吞作用和溶酶体降解来破坏HER2

已知受体稳定性受泛素-蛋白酶体和/或溶酶体机制调控。本研究发现MG132或Velcade抑制的蛋白酶体进一步降低了褪黑素处理后HER2蛋白的丰度(图3A， B)。相反，溶酶体抑制剂BAF恢复了降低的HER2水平(图3C)，表明褪黑素可能主要通过内吞溶酶体降解诱导HER2下调。

检测褪黑素对HER2+乳腺癌细胞中HER2蛋白的细胞定位的影响试验显示，HER2蛋白在未处理的HCC1954细胞的细胞膜上强烈表达并在细胞质中扩散，而在褪黑激素处理的细胞中以胞内点的形式出现(图3D)，提示褪黑素可能诱导HER2亚细胞运输。与此一致的是，流式细胞分析显示褪黑素以剂量依赖的方式显著减少了细胞表面HER2的数量(图3E)。这表明褪黑素在促进HER2内吞作用中的潜在作用。

褪黑素处理导致HSP90和HSC70表达降低，HSP70表达代偿性增加(图4A)，同时，在褪黑素处理的细胞中HSP90与HER2共免疫沉淀的数量也显著减少，提示褪黑素可能诱导HSP90从HER2分离(图4B)。褪黑素治疗导致HER2泛素化水平升高(图4B)。免疫荧光染色分析显示，褪黑素治疗可使内化的HER2明显定位为点状结构(图4C)。此外，在褪黑素处理的HCC1954细胞中，HER2与LAMP1(晚期核内体/溶酶体标记物)共定位(图4D)。再加上溶酶体抑制剂BAF可挽救褪黑素诱导的HER2下调(图3C)，这些数据都支持褪黑素通过促进内吞作用和溶酶体降解来破坏HER2的观点。

4、褪黑激素增强奈拉替尼在HER2+乳腺癌细胞中的细胞毒性作用

接下来将研究褪黑激素能否增强泛HER激酶抑制剂奈拉替尼在HER2+乳腺癌细胞的疗效。在所有测试的四种乳腺癌细胞系中观察到协同治疗反应后，通过克隆生存试验研究了药物联合的协同生长抑制作用。与单药治疗相比，褪黑素和奈拉替尼联合使用诱导的生长抑制作用明显更强(图5A， B)。在对HER2+乳腺癌迁移潜能试验中发现，褪黑素+奈拉替尼组的划痕区域间间隙比单药组更大(图5C)。虽奈拉替尼和褪黑素各自在较小程度上降低了HER2蛋白丰度和磷酸化HER2信号，但联合治疗产生更强的抑制作用(图5D)。褪黑素或奈拉替尼单独产生中度细胞毒性作用，但联合治疗显著增加细胞死亡(图5E)。综上所述，这些数据表明褪黑素和奈拉替尼联合对HER2+乳腺癌细胞具有协同治疗活性。

5、褪黑素和奈拉替尼联合使用可有效阻断异种HCC1954肿瘤的生长

与对照组相比，褪黑素和奈拉替尼单药治疗显著降低HCC1954异种移植瘤的生长(图6A)。值得注意的是，与单独使用褪黑素和奈拉替尼相比，联合使用褪黑素和奈拉替尼对肿瘤生长的抑制更大(以平均肿瘤体积和终点肿瘤重量计算)(图6A-D)，且只有联合治疗在一小部分肿瘤中实现了肿瘤逆转(5 / 8)(图6A， B)。与体外实验发现褪黑激素破坏HER2蛋白的结果一致，单独使用褪黑激素治疗的小鼠肿瘤显示HER2蛋白丰度显著降低(图6E)。我们还发现泛HER激酶抑制剂奈拉替尼降低了HER2蛋白丰度以及HER2信号通路(图6E和图5D)。此外，联合治疗在整个治疗过程中未产生明显的毒性作用。综上，联合使用褪黑激素和奈拉替尼或可提高对HER2 +乳腺癌治疗效果。

综上所述，本研究阐明了褪黑素和奈拉替尼在HER2+乳腺癌细胞中的联合治疗效果，证明了褪黑激素对HER2的破坏潜力。体外和体内实验结果都表明，褪黑素显著增强奈拉替尼对HER2阳性乳腺癌细胞的毒性作用，即使这些细胞含有PIK3CA突变而对HER2靶向药物反应较弱。未来研究将检验这个药物组合能否对her2靶向药物耐药的乳腺癌中发挥作用。

总的来说，该研究结果表明褪黑激素＋奈拉替尼有望成为治疗HER2阳性乳腺癌的HER2双重阻断新策略。